比較兩種轉錄激活系統(tǒng)對生殖相關基因的表達調控

盧佳豪,黃亞萍,羅 芳,肖亞梅,趙小陽*

(1.湖南師范大學生命科學學院省部共建淡水魚類發(fā)育生物學國家重點實驗室,中國湖南長沙410081;2.南方醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院發(fā)育生物學教研室,中國廣東廣州510515)

規(guī)律成簇間隔短回文重復(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)是細菌和古生菌細胞保護自身不受病毒侵害的防御系統(tǒng)[1]。當微生物遭到病毒入侵時,CRISPR RNA通過互補配對結合到病毒基因組,并通過核酸酶Cas9特異性地切割病毒DNA,以實現自我保護[2]。近年來,大量研究應用CRISPR-Cas9技術在人、小鼠、猴、斑馬魚和擬南芥等多個物種上進行了基因敲除,此外研究者們通過突變Cas9的兩個核酸酶結構域HNH和RuvC,產生沒有切割活性但在sgRNA(single guide RNA)的引導下仍能特異性識別并結合靶向序列的dCas9(dead-Cas9)[3]。dCas9可與不同功能的蛋白質結構域融合,從而實現定向的基因轉錄調控(包括轉錄激活及轉錄抑制)、表觀遺傳學修飾以及染色體可視化等方面的應用。其中,CRISPR介導的轉錄激活系統(tǒng)(CRISPR activation,CRISPRa),是將dCas9與轉錄激活因子或組蛋白修飾酶的核心結構域進行融合來實現基因的靶向激活[4]。

最初,CRISPRa系統(tǒng)是將dCas9與多個串聯的VP16轉錄激活域(如VP64、VP160等)融合來激活內源性基因表達,但效率較低[5]。隨后,研究者們嘗試篩選不同轉錄激活復合物來優(yōu)化系統(tǒng),統(tǒng)稱為二代激活系統(tǒng),包括由VP64、p65AD和巴爾病毒Rta反式激活因子組成的VPR系統(tǒng)及MS2、p65和HSF1轉錄激活蛋白質組成的SAM系統(tǒng)[3]。此外,還有團隊將Cas9與人乙酰轉移酶p300的催化核心結構域進行融合,構成Cas9-p300系統(tǒng),該系統(tǒng)通過催化靶基因啟動子或增強子上的H3Lys27實現乙?；?使得靶基因染色質結構變得疏松,進而招募轉錄激活因子來激活靶基因的表達[3]。二代激活系統(tǒng)提高了轉錄激活效率,因此近年來不斷有研究者應用CRISPRa來實現細胞定向分化或重編程。此外,有研究者通過使用CRISPRa系統(tǒng)激活內源性Fst(follistatin)基因的表達,在一定程度上緩解了肌營養(yǎng)不良癥的小鼠肌肉萎縮的表型[6],這表明CRISPRa系統(tǒng)的基因激活在疾病模型及治療方面具有應用潛力。

本文旨在比較Cas9-p300與dCas9-VPR兩個系統(tǒng)對生殖發(fā)育相關基因的激活效率,這將為研究生殖細胞分化及未來利用轉錄激活系統(tǒng)實現細胞命運轉變提供基礎,也將為其他發(fā)育系統(tǒng)的基因功能研究或定向分化應用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 細胞

人腎上皮細胞293T為本實驗室所有。感受態(tài)細胞DH5α和stbl3購自深圳康體生命科技有限公司。

1.2 載體

載體p2U6-Cas9-p300-mCherry為本實驗室所有。載體PB-TRE-dCas9-VPR(#63800)、MLM-3636(#43860)購自 Addgene 官網(http：//www.addgene.org/)。

兩個轉錄激活系統(tǒng)的載體分別是p2U6-Cas9-p300-mCherry和 PB-TRE-dCas9-VPR(圖 1),其中Cas9-p300系統(tǒng)由野生型Cas9與乙酰轉移酶p300形成融合蛋白。

圖1 載體結構示意圖以及載體構建示意圖(A)p2U6-Cas9-p300-mCherry載體結構示意圖;(B)PB-TRE-dCas9-VPR載體結構示意圖;(C)MLM3636載體結構示意圖。Fig.1 Schematic of transcription activation systems(A)p2U6-Cas9-p300-mCherry system;(B)PB-TRE-dCas9-VPR system;(C)MLM3636 system.

1.3 試劑

限制性內切酶BsmB I(#R0613L,美國NEB公司);T4連接酶(#M0202V,美國NEB公司);質粒小提試劑盒(DC201,南京諾唯贊生物科技有限公司);DNA純化回收試劑盒(DC301,南京諾唯贊生物科技有限公司);細胞轉染試劑Peimine(ab-143678,英國Abcam公司);Trizol(R401-01,南京諾唯贊生物科技有限公司);HiScript Q RT Super-Mix for qPCR(gDNA wiper)(R123-01,南京諾唯贊生物科技有限公司);A301 2×RealStar Green Fast Mixture(A301-10,北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養(yǎng)

將293T細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,在37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。

1.4.2 sgRNA設計

根據CRISPR/Cas9原理中sgRNA設計原則,將目的基因1號外顯子上游promoter 200 bp區(qū)域序列提交至在線設計sgRNA的網站(http：//chopchop.cbu.uib.no/),待系統(tǒng)生成推薦序列后選擇高評分序列作為備選sgRNA,詳細信息見表1。

1.4.3 重組表達sgRNA載體

BsmB I酶切后回收的MLM3636載體骨架與sgRNA退火后的雙鏈DNA(dsDNA)利用T4連接酶進行連接反應,連接產物轉化到DH5α感受態(tài)細胞中。將轉化好的感受態(tài)細胞涂布于含氨芐青霉素(ampicillin)的LB培養(yǎng)基標準平板上。挑取單克隆進行菌液PCR鑒定,將PCR檢測陽性的克隆加入含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中進行連續(xù)培養(yǎng),12 h后提取質粒,送往北京睿博興科生物技術有限公司進行核酸檢測,查看sgRNA是否正確整合進入載體。

1.4.4 轉染293T細胞

當293T細胞密度達到50%時,利用 PEI(polyethylenimine)法共轉染轉錄激活系統(tǒng)載體與sgRNA的載體,從而激活目的基因。具體而言,在分別轉染兩種不同的轉錄激活載體p2U6-Cas9-p300-mCherry和PB-TRE-dCas9-VPR的同時,轉染帶有相同sgRNA的載體MLM3636-sgRNA,由此比較這兩種轉錄激活系統(tǒng)對同一個基因的激活效率。另外,設置對照組為僅轉染轉錄激活系統(tǒng)載體的293T細胞。

1.4.5 總RNA提取與逆轉錄

收取轉染72 h后的293T細胞,用Trizol法提取RNA。利用諾維贊HiScript Q RT SuperMix for qPCR(gDNA wiper)試劑盒對提取的RNA進行逆轉錄。每個RNA樣本取1 μg總量進行逆轉錄,生成cDNA。

1.4.6 實時熒光定量PCR

以合成的cDNA為模板,使用A301 2×RealStar Green Fast Mixture對樣本進行表達檢測。每次定量分析設3個重復樣品,PCR引物信息見表2。以GAPDH為內參基因,以no gRNA組為對照樣本,進行歸一化處理,對比Cas9-p300和dCas9-VPR系統(tǒng)的激活效率。實驗結果以平均值±標準誤差表示。組間比較利用GraphPad Prism 6軟件進行t-test分析。無顯著差異(NS)為P＞0.05,顯著性差異為P＜0.05,極顯著性差異為P＜0.01。

表1 基因靶點序列Table 1 The target sequences of genes

表2 實時熒光定量PCR引物序列Table 2 The primer sequences for real-time quantitative PCR assay

2 結果

2.1 靶向目的基因啟動子區(qū)域的sgRNA載體構建

由于本文應用的轉錄激活系統(tǒng)Cas9-p300是利用野生型Cas9與乙酰轉移酶p300形成的系統(tǒng),在長度為20個堿基的sgRNA引導下會對DNA雙鏈進行切割,而14～15個堿基的 sgRNA(短gRNA)能夠引導Cas9到靶位點且阻止DNA雙鏈斷裂[6]。因此,我們構建長度為14 bp的sgRNA對目的基因進行激活(圖2A)。

首先合成兩條互補的oligo序列,并在正義鏈5＇端添加ACAC,反義鏈 5＇端添加AAAA作為黏性末端,隨后將其退火形成互補的DNA雙鏈。將退火的雙鏈DNA連接到通過限制性內切酶BsmBⅠ線性化的載體MLM3636,從而形成攜帶sgRNA的重組載體(圖2A)。重組載體經菌落PCR鑒定及進一步的測序分析證實,sgRNA均正確插入到MLM3636載體,說明靶向目的基因啟動子區(qū)域的sgRNA載體構建成功(圖2B～E)。

圖2 sgRNA載體構建示意圖以及部分載體測序結果(A)載體MLM3636-gRNA構建流程圖;(B)～(E)針對目的基因NANOS2設計的sgRNAs(NANOS2-1～NANOS2-4)及其所構建載體的測序結果。Fig.2 Schematic of sgRNA vector construction and partial vector sequencing results(A)The construction process of recombinant plasmid MLM3636-gRNA;(B)～(E)sgRNAs(NANOS2-1～NANOS2-4)designed for target gene NANOS2,and the sequencing results of the constructed vectors containing above sgRNAs.

2.2 轉錄激活系統(tǒng)高效轉染293T細胞

我們針對 BLIMP1、TFAP2C、DDX4、NANOS2、SOX17和DAZL 6個基因分別設計了多個sgRNA,并將sgRNA載體與p2U6-Cas9-p300-mCherry或PB-TRE-dCas9-VPR載體共同轉染入293T細胞內。由于p2U6-Cas9-p300-mCherry載體攜帶紅色熒光標記蛋白質mCherry,所以我們能通過熒光體視顯微鏡觀測到紅色熒光的發(fā)光效率并能以此監(jiān)測PEI法轉染293T細胞的實時效率。結果顯示,利用PEI轉染法轉染p2U6-Cas9-p300-mCherry轉錄激活系統(tǒng)的效率高達90%以上(圖3)。

2.3 實時熒光定量PCR比較兩個系統(tǒng)對不同基因的激活效率

為比較兩種轉錄激活系統(tǒng)的激活效率,我們收取了轉染72 h后的293T細胞并且提取了RNA。將RNA逆轉錄成cDNA后,通過實時熒光定量PCR檢測目的基因的表達水平,結果如圖4所示。

熒光定量PCR結果顯示,Cas9-p300與dCas9-VPR能夠上調5個基因的表達,分別是BLIMP1、TFAP2C、NANOS2、SOX17 和 DAZL,但對 DDX4基本無效。需要指出的是,Cas9-p300系統(tǒng)對BLIMP1基因表現出更高的激活效率。其中sgRNA-1和sgRNA-2對應的激活效率約為108倍,而dCas9-VPR系統(tǒng)的激活效率約為50倍,差異均具有顯著性(P＜0.05);但是在BLIMP1 sgRNA-3(P＜0.05)與 sgRNA-5(P＜0.01)誘導下,dCas9-VPR系統(tǒng)的激活效率比Cas9-p300系統(tǒng)更高。其次,dCas9-VPR 系統(tǒng)在激活 NANOS2、SOX17、DAZL這3個基因時比Cas9-p300系統(tǒng)更為有效(P＜0.05)。兩個系統(tǒng)在sgRNA-4誘導下對TFAP2C均達到最高激活效率,并且兩者之間無顯著差異。而g1～g3所對應的相對表達水平雖具有統(tǒng)計學差異,但兩者對目的基因TFAP2C的激活倍數太低,無法被認定為有效激活。關于兩個系統(tǒng)對TFAP2C激活效率都不高的情況,我們推測可能與該基因本底表達較高[5]有關。綜上所述,Cas9-p300系統(tǒng)與dCas9-VPR系統(tǒng)對不同基因或同一基因選用不同的sgRNA,所產生的激活效率會有所不同。

3 討論

圖3 sgRNA與Cas9-p300系統(tǒng)共轉染293T細胞48 h后的熒光圖BF 表示 293T 細胞的白光圖(標尺：200 μm)。Fig.3 Fluorescence images of 293T cells after transfection 48 h with sgRNA and Cas9-p300BF represents bright field image of 293T cells(scale bar：200 μm).

之前的研究表明,利用第二代轉錄激活系統(tǒng)VPR、SAM和Suntag在293T細胞中對相同的6個目的基因進行激活時,SAM系統(tǒng)在提供高效率的基因誘導方面最為穩(wěn)定,而且與其他兩種系統(tǒng)的差異不會大于5倍;VPR和Suntag系統(tǒng)則在特定的一些基因中表現出比其他系統(tǒng)更為高效的激活效率[7～8]。由于每個激活系統(tǒng)具有各自不同的原理和特點,因而在對一些特異性基因進行激活時尚不能明確哪種系統(tǒng)是最有效的[9～10]。

本研究利用Cas9-p300與dCas9-VPR兩種不同的轉錄激活系統(tǒng),對生殖細胞特化相關基因的啟動子區(qū)域進行內源性激活,比較了在相同gRNA的引導下Cas9-p300與dCas9-VPR轉錄激活系統(tǒng)在293T細胞中的激活效率。結果表明,在對生殖細胞特化相關基因進行激活時,激活效率呈現出以下3種模式：1)Cas9-p300系統(tǒng)更高效(BLIMP1);2)dCas9-VPR系統(tǒng)的效率更高(NANOS2、SOX17、DAZL);3)兩個系統(tǒng)的激活效率相近。我們推測造成激活效率不同的原因可能是不同基因的染色質開放狀態(tài)不同,這使得作用方式不同的系統(tǒng)產生不同的激活效率。上述結果說明,不同的轉錄激活系統(tǒng)在激活生殖細胞特化基因時,具有不同的效率,這為實現靶基因的激活提供了候選策略。由此,本研究為后續(xù)研究生殖細胞分化鋪墊了基礎,也為利用轉錄激活系統(tǒng)研究細胞命運轉變提供了借鑒。

圖4 兩個系統(tǒng)對不同基因的激活效率分析橫坐標表示不同的gRNA,縱坐標表示該gRNA對目的基因表達水平的影響。**：P＜0.01;*：P＜0.05。Fig.4 Activation efficiencies of the two systems for expression of different genes in 293T cellsThe horizontal coordinates denote different gRNAs,and the longitudinal coordinates represent the corresponding expression levels of target genes.**：P＜0.01;*：P＜0.05.