冷凍切片機(jī)在細(xì)胞塊制作中的應(yīng)用

劉澤平(通信作者)，鐘福杭，蔣小英，湯曉暉

1 福建省龍巖市第二醫(yī)院病理科 (福建龍巖 364000)；2 福建省上杭縣醫(yī)院病理科 (福建龍巖 364200)；3 福建省龍巖市第一醫(yī)院病理科 (福建龍巖 364000)

細(xì)胞塊技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床病理工作中，并能同時(shí)應(yīng)用免疫組織化學(xué)及分子病理檢測，能提高診斷的靈敏度及特異度。目前制作細(xì)胞塊主要有試管包埋法、普通離心沉淀法、血清凝聚法及瓊脂凝聚法等[1-4]，但若標(biāo)本的細(xì)胞量較少則難以制作成組織塊。本研究介紹一種操作簡單、費(fèi)用低，但制成的組織塊細(xì)胞量較多的細(xì)胞塊制作方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2015年1月至2017年12月龍巖市第一醫(yī)院、龍巖市第二醫(yī)院病理科胸腹水樣本共168例，要求樣本細(xì)胞量較大，在制作常規(guī)細(xì)胞涂片后有剩余足量細(xì)胞量以便制成細(xì)胞塊，同時(shí)有活檢或手術(shù)標(biāo)本并有明確診斷。樣本中女87例,男81例,年齡35～86歲,平均 (59.6±5.9) 歲。本研究得到兩醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1傳統(tǒng)細(xì)胞病理學(xué)檢查

(1)送檢標(biāo)本靜置20～30 min；(2)棄上清液，取底部沉積物40 ml于離心管中，2 500 r/min離心5 min，棄上清液；(3)將所得細(xì)胞沉淀物與中性福爾馬林按1∶2比例混勻，靜置1～4 h后，以2 500 r/min離心5 min，棄上清液；(4)用棉簽將部分標(biāo)本單向、均勻地涂抹于載玻片上；(5)進(jìn)行常規(guī)蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-Enosin staining，HE染色)，試劑均由珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供，按試劑盒上流程操作。

1.2.2細(xì)胞塊制備

(1)將1.2.1中所余標(biāo)本的試管放置冷凍切片機(jī)凍臺(tái)上(LECAI 德國，CM1520)，(溫度：-18℃至-25℃，時(shí)間5～8 min)，使沉淀物形成冰塊；(5)將試管放置80℃左右水中，時(shí)間3～4 min，讓緊貼試管的冰塊稍融化；(6)將試管倒置顯微鏡拭鏡紙上，使細(xì)胞塊與試管分離；(7)細(xì)胞塊表面滴些冷凍切片膠水，用拭鏡紙封包；(8)上述細(xì)胞塊可按常規(guī)組織進(jìn)行脫水、浸蠟、包埋、切片等處理制成細(xì)胞蠟塊。

1.2.3染色方法

(1)常規(guī)HE染色(操作同1.2.1)；(2)免疫組化染色，用快捷免疫組化S-P法染色；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)及Maxvision試劑盒，二抗：廣譜細(xì)胞角蛋白(Cytokeratin-Pan CK-Pan,鼠抗人單克隆抗體)、Ki-67(鼠抗人單克隆抗體)等均由邁新公司(福州)提供，并由主管病理技師操作以確保實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。

1.3 顯微鏡閱片

均采用雙盲法，由兩名細(xì)胞病理學(xué)高年資主治醫(yī)師同時(shí)閱片，并做出一致性診斷。依據(jù)《漿膜腔積液細(xì)胞病理學(xué)診斷》標(biāo)準(zhǔn)，診斷報(bào)告采用3級(jí)分類法，即找到惡性細(xì)胞(鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、小細(xì)胞未分化癌、大細(xì)胞未分化癌、腺鱗癌、癌型未定)為陽性，可疑惡性細(xì)胞為不確定性，及未找到惡性細(xì)胞為陰性。綜合活檢或手術(shù)標(biāo)本常規(guī)病理為最終確診結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)， 等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

采用上述方法制備細(xì)胞塊，收集的細(xì)胞完整，不易碎，對細(xì)胞量較少的標(biāo)本也能比傳統(tǒng)方法收集較多量細(xì)胞；且成本低，操作簡單。HE染色中細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，紅染及藍(lán)染染色鮮艷，細(xì)胞核、核染色質(zhì)顆粒清楚,核膜清晰,均質(zhì)深藍(lán)染色,核仁明顯呈紫紅色,顏色鮮艷，對比性強(qiáng)，無背景著色；同時(shí)可以看到腫瘤組織結(jié)構(gòu)，見圖1。

2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

抗體CK：癌細(xì)胞胞漿黃染顆粒定位準(zhǔn)確，其他部位未見黃染顆粒(圖2)?？贵wKi-67：腫瘤細(xì)胞胞核黃染顆粒定位準(zhǔn)確，對比性較強(qiáng)，其他部位未見黃染顆粒(圖3)。

圖1 HE染色,x200圖2 CK-Pan S-P法免疫組化染色x200圖3 Ki-67 S-P法免疫組化染色x200

2.3 兩種方法診斷情況比較

168例樣經(jīng)高年資主治醫(yī)生診斷后，細(xì)胞塊診斷情況優(yōu)于傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩種方法診斷情況比較(n %)

注：兩種方法比較，χ2=91.17，P<0.05

3 討論

細(xì)胞塊方法最早于1896年由Bahrenburg創(chuàng)造[5]，目前我國臨床病理工作中，制作細(xì)胞塊的方法很多，且各有優(yōu)點(diǎn)[1-4]。本研究所用方法由于冷凍前已將細(xì)胞充分用中性福爾馬林固定，因此細(xì)胞冷凍不會(huì)破壞其酸堿性及丟失表面抗原，離心加冷凍提高了細(xì)胞收集率，且細(xì)胞保存良好，無皺縮和變性，蘇木精把胞核染成藍(lán)色,伊紅把胞質(zhì)染成紅色，以及抗體定位準(zhǔn)確及表達(dá)強(qiáng)度較高的免疫組織化學(xué)切片，最終能制出高質(zhì)量HE染色[9]。168例樣本通過本方法明顯提高了陽性確診率，減少了不確定(可疑)率；且極大的減少了誤診率，為臨床繼續(xù)治療提供更無創(chuàng)的確診方法。

細(xì)胞塊比傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)能作出更明確的細(xì)胞病理學(xué)診斷，該技術(shù)也是簡單，安全，經(jīng)濟(jì)且可重復(fù)的[10]。細(xì)胞塊為形態(tài)學(xué)提供了最佳環(huán)境，背景染色非常少，診斷結(jié)果最接近組織病理學(xué)診斷[11]。胸水或腹水中的惡性細(xì)胞幾乎均是轉(zhuǎn)移性腫瘤，間皮細(xì)胞引起的原發(fā)性惡性腫瘤并不常見。惡性細(xì)胞的及時(shí)診斷是癌癥患者的重要預(yù)后指標(biāo)[12]。惡性胸水是肺癌、乳腺癌和胃癌等晚期癌癥的常見并發(fā)癥和適應(yīng)癥。惡性腹水是由于卵巢癌、結(jié)腸癌、肝癌和胰腺癌導(dǎo)致的。因此，診斷胸水、腹水是否存在惡性細(xì)胞已被作為癌癥的常規(guī)診斷程序。細(xì)胞塊比傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)更能突顯腫瘤的組織結(jié)構(gòu)，也有更多組織切片便于免疫組化及基因檢測等。

由于診斷醫(yī)師業(yè)務(wù)有待提高，導(dǎo)致細(xì)胞塊存在個(gè)別誤診，因此本方法也得基于專業(yè)水平較高醫(yī)生的前提下才能更有效開展。組織學(xué)檢查雖為目前診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但取材較困難，費(fèi)用較高。本方法操作簡易，成本低，可操作性強(qiáng)。