苦參素預(yù)處理對腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及對核轉(zhuǎn)錄因子-κB表達(dá)影響

郝朝輝 張 楠

鄭州人民醫(yī)院泌尿外科，河南省鄭州市 450000

腎缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷是臨床上腎移植術(shù)等過程中不可避免的病理生理現(xiàn)象，嚴(yán)重時(shí)可引起腎功能衰竭[1]。I/R的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，與氧自由基損傷、炎癥反應(yīng)等因素有關(guān)。大量證據(jù)顯示，I/R損傷時(shí)，腎組織的炎癥反應(yīng)加劇，多種炎性細(xì)胞因子被釋放，同時(shí)產(chǎn)生大量活性氧自由基，造成氧化應(yīng)激損傷[2-3]。此外，有研究表明炎癥、缺氧等刺激會激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Nuclear factor-κB, NF-κB)，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子釋放，加劇炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致缺血再灌注損傷[4]。因此，有效地抑制機(jī)體炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)是改善腎缺血再灌注損傷的重要途徑。苦參素(Oxymatrine，OMT)是一種具有抗凋亡、抗炎及抗氧化等藥理作用的生物堿，可減輕腎缺血再灌注損傷，但具體分子機(jī)制尚不明確[5]。因此本研究擬通過觀察OMT對大鼠腎缺血再灌注保護(hù)作用及NF-κB信號途徑的影響，探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及試劑 SPF級SD大鼠40只，雄性，體重200～220g，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。所有動物實(shí)驗(yàn)均由鄭州人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)通過。苦參素(200mg/2ml，批準(zhǔn)文號：H20044669，生產(chǎn)：云南白藥集團(tuán)股份有限公司)；血清Cr、BUN、IL-1β、IL-6、TNF-α、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及BCA法總蛋白定量試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗大鼠NF-κB p65一抗和β-actin抗體及羊抗兔或羊抗鼠IgG均購自英國Abcam公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 將大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組(S組)、缺血再灌注組(I/R組)、OMT高劑量組(H組)、OMT低劑量組(L組)，每組10只。L組和H組于I/R造模前1h分別給予苦參素75mg/kg、150mg/kg腹腔注射，S組和I/R組同時(shí)給予同體積0.9%氯化鈉注射液。I/R模型制備[6]：將I/R組和OMT預(yù)處理組大鼠進(jìn)行腹腔注射10%水合氯醛麻醉，俯臥位固定，碘伏消毒，取腹正中切口進(jìn)入腹腔，游離雙側(cè)腎臟并切除右腎，用無損傷動脈夾夾閉左側(cè)腎動、靜脈，腎臟從紅色轉(zhuǎn)成暗紅色視為缺血成功；阻斷45min后取下動脈夾進(jìn)行再灌注，再灌注時(shí)腎臟從暗色轉(zhuǎn)變成鮮紅色視為再灌注成功。再灌注完成后消毒、縫合，待大鼠完全蘇醒后放回飼養(yǎng)籠中飼養(yǎng)。S組除不進(jìn)行腎動、靜脈夾閉外，其他操作與I/R組一致。于再灌注24h后收集大鼠下腔靜脈血，然后頸椎脫臼處死大鼠獲取腎臟組織，一部分迅速置于-80℃中保存，另一部分用多聚甲醛固定。

1.3 腎損傷指標(biāo)的測定 將大鼠血液標(biāo)本離心，獲取血清，采用全自動生化分析儀測定Cr和BUN的濃度。

1.4 腎臟組織病理學(xué)檢查 取多聚甲醛固定的腎臟組織，脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟， HE染色，在400×光鏡下觀察其病理改變。

1.5 炎性細(xì)胞因子的檢測 ELISA試劑盒檢測各組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α的水平，嚴(yán)格按照試劑盒操作進(jìn)行。

1.6 氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測 取出部分腎組織制成勻漿，而后采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD的活性，采用硫代巴比妥酸法測定MDA的含量，同時(shí)采用二硫代二硝基甲苯胺法測定GSH-Px活力，嚴(yán)格按照試劑盒操作進(jìn)行。

1.7 Western blot檢測NF-κB表達(dá) 使用核蛋白提取試劑盒提取剩余部分腎組織蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。分別取20μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜(PVDF膜)后，采用5%BCA室溫封閉2h，分別加入NF-κB p65一抗和β-actin 抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜，然后室溫孵育羊抗兔或羊抗鼠二抗(1∶2 000)1h?；瘜W(xué)發(fā)光顯影后采用Image J計(jì)算目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值，即目的蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 腎臟組織病理形態(tài)學(xué)變化 各組大鼠腎臟組織病理學(xué)觀察結(jié)果如圖1， I/R組大鼠腎小管上皮細(xì)胞明顯變性壞死，大量炎性細(xì)胞浸潤，可見管型；OMT預(yù)處理組大鼠僅部分近曲小管細(xì)胞輕度水腫、變性、壞死，偶見管型，且H組效果更明顯。

注：A:S組，B:I/R組，C:L組，D:H組。

2.2 腎損傷指標(biāo)和炎性因子水平比較 各組大鼠腎損傷指標(biāo)和炎性因子水平比較見表1，I/R組血清Cr、BUN、IL-1β、IL-6及TNF-α水平明顯高于S組 (P<0.05)； OMT預(yù)處理組血清Cr、BUN、IL-1β、IL-6及TNF-α水平顯低于I/R組(P<0.05)，且H組效果更明顯，提示OMT預(yù)處理能抑制炎癥反應(yīng)。

表1 各組血清Cr、BUN、IL-1β、IL-6及TNF-α水平的比較

注：a與S組比較,P<0.05;b與I/R組比較,P<0.05。

2.3 OMT影響I/R大鼠腎臟組織氧化應(yīng)激指標(biāo)水平 如表2所示，與S組比較，I/R組大鼠腎臟組織中MDA含量明顯增加，抗氧化酶SOD和GSH-Px的活力明顯下降(P<0.05)；與I/R組比較，OMT預(yù)處理組大鼠腎臟組織中MDA含量明顯降低，SOD和GSH-Px的活力明顯升高(P<0.05)，且H組更明顯，提示OMT預(yù)處理能夠提高I/R大鼠腎臟組織的抗氧化能力。

表2 各組腎臟組織MDA、SOD及GSH-Px水平比較

注：a與S組比較,P<0.05;b與I/R組比較,P<0.05。

2.4 苦參素影響I/R大鼠腎臟組織NF-κB p65蛋白表達(dá)水平 由圖2可以看出，I/R組腎臟組織NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯高于S組(P<0.05)；OMT預(yù)處理組腎臟組織NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯低于I/R組(P<0.05)，且H組更明顯。

注：* 與S組比較,P<0.05; #與I/R組比較,P<0.05。

3 討論

腎臟是維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的最重要的器官之一，腎I/R損傷在臨床工作中較常見[7]。研究表明氧自由基損傷及炎性反應(yīng)是導(dǎo)致I/R損傷的重要原因之一，但其具體機(jī)制尚不明確[8]。I/R發(fā)生時(shí)，IL-1β、IL-6及TNF-α等炎性細(xì)胞因子被釋放，使腎組織的炎癥反應(yīng)加劇，進(jìn)而加重I/R的發(fā)生[9]，同時(shí)腎組織會產(chǎn)生大量活性氧自由基，與生物膜上不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)生大量脂質(zhì)過氧化物，且抑制SOD、GSH-Px等抗氧化酶的活性，使氧自由基大量累積，最終引起腎細(xì)胞損傷、凋亡和壞死[10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與S組相比，I/R組大鼠腎組織損傷嚴(yán)重，血清TNF-α、IL-6、IL-1β的水平以及腎組織MDA水平明顯升高，抗氧化酶SOD和GSH-Px的活力明顯降低，說明腎I/R損傷加劇了大鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，減弱了抗氧化能力，引起腎組織的損傷和壞死。

OMT可通過抗炎、抗凋亡、抗氧化清除自由基等途徑，保護(hù)肺、心臟及腦等的I/R損傷[11]。Zhu等[12]研究發(fā)現(xiàn)OMT可上調(diào)IL-10水平，下調(diào)TNF-α、IL-8水平，抑制肺泡細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，緩解肺I/R損傷；Jiang等[13]研究發(fā)現(xiàn)OMT預(yù)處理可減輕組織學(xué)損傷和氧化應(yīng)激，抑制腎小管細(xì)胞凋亡，上調(diào)Nrf2/HO-1蛋白的表達(dá)，減輕腎I/R損傷；Ozturk等[14]研究發(fā)現(xiàn)OMT可能是一種有效的抗氧化藥物，可通過抑制脂質(zhì)過氧化和增加內(nèi)源性抗氧化活性保護(hù)腎臟免受損傷。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)OMT預(yù)處理后，大鼠的腎細(xì)胞壞死、炎性細(xì)胞浸潤比例明顯降低，血清Cr、BUN、IL-1β、IL-6及TNF-α的水平明顯降低，腎組織中MDA含量明顯下降，SOD和GSH-Px的活力明顯升高，且H組效果更明顯，提示OMT能夠降低I/R大鼠的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高機(jī)體的抗氧化能力，減少腎I/R損傷，保護(hù)腎組織。

NF-κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在真核生物細(xì)胞中，可誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子表達(dá)，在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及I/R損傷等病理生理改變過程中起著重要的調(diào)控作用[15]。已有研究表明炎癥、缺氧等刺激會激活NF-κB，促進(jìn)IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性細(xì)胞因子的釋放，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致I/R損傷[16]。本研究結(jié)果顯示，I/R組腎臟組織NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯高于S組，說明活化的NF-κB參與腎I/R損傷的發(fā)生。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)OMT預(yù)處理組腎臟組織NF-κB p65蛋白表達(dá)水平明顯低于I/R組，提示OMT預(yù)處理可通過某種機(jī)制抑制NF-κB 的活化，下調(diào)多種分子表達(dá)，減少炎性介質(zhì)的釋放，從而減輕腎臟缺血再灌注損傷，進(jìn)而保護(hù)腎臟功能。

綜上所述，OMT預(yù)處理對腎臟有保護(hù)作用，其機(jī)制與增強(qiáng)腎臟抗氧化能力，減輕炎癥反應(yīng)，抑制NF-κB p65表達(dá)有關(guān)。