地黃炮制過(guò)程中毛蕊花糖苷含量動(dòng)態(tài)研究

單國(guó)順,趙啟苗,李 睿,高 陸,鞠成國(guó),賈天柱*

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,遼寧 大連116600；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 杏林學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng)110167；3.天津市濱海新區(qū)中醫(yī)醫(yī)院 藥學(xué)科,天津300457；4.修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司,吉林 長(zhǎng)春130000)

地黃是玄參科植物地黃(Rehmannia glutinosa Libosc h.)的干燥塊根,具有清熱涼血、養(yǎng)陰生津的功效。熟地黃為生地黃經(jīng)蒸制所制成的加工品,功效為滋陰補(bǔ)血、益精填髓。2015版《中國(guó)藥典》中規(guī)定地黃的質(zhì)量控制指標(biāo)為環(huán)烯醚萜苷類成分梓醇和苯乙醇苷類成分毛蕊花糖苷。然而,由于環(huán)烯醚萜苷類成分的熱穩(wěn)定性較差,使其多在地黃蒸制的過(guò)程中損失殆盡。因此,2015版《中國(guó)藥典》中僅保留毛蕊花糖苷的含量作為熟地黃的質(zhì)量控制指標(biāo)[1]。毛蕊花糖苷(verbascoside)又名阿克苷、麥角甾苷、洋丁香酚苷,作為一個(gè)苯丙素苷化合物,其具有很強(qiáng)的抗炎、抗氧化作用,并可調(diào)節(jié)骨代謝、生殖系統(tǒng)及消化系統(tǒng)的功能[2-4],這些作用也均與地黃生制品的“滋陰”作用相一致。然而,有研究[5,6]表明,地黃經(jīng)蒸制后毛蕊花糖苷的含量會(huì)發(fā)生明顯降低。那么,為了提高熟地黃的質(zhì)量和臨床療效,有必要搞清楚在地黃炮制過(guò)程中有哪些因素影響了毛蕊花糖苷的含量,以便進(jìn)一步提高其在熟地黃中的含量,從而為臨床提供真正“質(zhì)優(yōu)效確”的熟地黃飲片。在本研究中,筆者采用HPLC法分析了熟地黃炮制時(shí)間、加工方式等因素對(duì)毛蕊花糖苷含量的影響情況,以期為高含量毛蕊花糖苷地黃飲片的炮制提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

日本島津公司LC-20AB液相色譜儀(LC-20AB泵,CTO-20A柱溫箱,SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器,CBM-20A數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換器)；LC-Solution色譜數(shù)據(jù)工作站；METTLER AE240型十萬(wàn)分之一分析天平(瑞士METTLER)；FA1004B電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；X/WT數(shù)顯調(diào)節(jié)儀電熱恒溫水浴鍋(余姚市顯星儀器有限公司)；電熱恒溫干燥箱(上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械一廠)。

1.2 藥材與試藥

地黃鮮品采自河南武陟縣,經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室翟延君教授鑒定為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosaLibosch.的新鮮塊根,采挖后洗凈泥砂,60℃干燥,制成生地。輔料黃酒購(gòu)自紹興舜豐釀酒有限公司,批號(hào)：20160507。

毛蕊花糖苷對(duì)照品(四川省維克奇生物科技有限公司,批號(hào)wkq16062004,經(jīng)HPLC測(cè)定純度大于98%)；乙腈為色譜純,水為純凈水,其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 樣品制備

稱取生地黃飲片及個(gè)子各1 000 g,按照每100 kg藥材加40 kg水的比例進(jìn)行回潤(rùn),回潤(rùn)后的地黃飲片及個(gè)子分別留樣100g,并于60℃干燥,得樣品S0和T0。剩余樣品分為兩份,一份于高壓鍋內(nèi)采用高壓蒸制,蒸制4 h,并于60℃干燥,得樣品S1和T1；另一份置蒸鍋內(nèi)常壓蒸制,并分別于4、8、12、24、36 h取樣,切厚片(個(gè)子),60℃干燥,即得樣品S2(T2)、S3(T3)、S4(T4)、S5(T5)、S6(T6)。

2.2 毛蕊花糖苷含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為WelchXtimateC18(4.6 mm×250 mm,5μm),柱溫：35℃,流速：1.0 m L·min-1,PDA檢測(cè)器,檢測(cè)波長(zhǎng)：334 nm,流動(dòng)相：0.1%醋酸水-乙腈(82∶18),進(jìn)樣體積：20μL。詳細(xì)色譜見(jiàn)圖1。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 取毛蕊花糖苷對(duì)照品適量,精密稱定,置于25 m L量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,制成每1 m L含0.22mg毛蕊花糖苷的對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 取地黃、熟地黃樣品粉末約2.0 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,精密加入甲醇100m L,稱定重量,加熱回流提取0.5 h,放冷,再稱定重量,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過(guò),精密量取續(xù)濾液50 m L,濃縮至近干,殘?jiān)恿鲃?dòng)相溶解,轉(zhuǎn)移至10 m L容量瓶中,并用水稀釋至刻度線,搖勻,用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾,取續(xù)濾液,即得。

圖1 HPLC 色譜

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取毛蕊花糖苷對(duì)照品溶液1、2、5、10、20、40μL,按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)X,峰面積為縱坐標(biāo)Y,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果線性回歸方程為Y=1494100X+18715(r=0.9999),表明毛蕊花糖苷在0.22～8.8 g·L-1濃度范圍內(nèi)與其峰面積具有良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取上述對(duì)照品溶液,在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次,每次10μL,記錄各自峰面積,結(jié)果毛蕊花糖苷峰面積的RSD為0.61%,表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取熟地黃供試品溶液,室溫放置,分別于0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣分析,每次20μL,記錄各自峰面積,毛蕊花糖苷峰面積的RSD為0.89%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一熟地黃樣品粉末6份,按“2.2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液,按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析,結(jié)果毛蕊花糖苷含量的RSD為0.71%,表明本法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的熟地黃(毛蕊花糖苷含量0.256 mg·g-1)6份,每份約1.0g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,各加入毛蕊花糖苷對(duì)照品溶液1 m L,按“2.2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液,在“2.2.1”色譜條件下進(jìn)樣分析,計(jì)算毛蕊花糖苷的回收率,結(jié)果平均回收率為99.41%,RSD為1.48%,說(shuō)明該方法準(zhǔn)確可靠。詳見(jiàn)表1。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 取毛蕊花糖苷對(duì)照品適量,精密稱定,置于25 m L量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,制成每1m L含0.22 mg毛蕊花糖苷的對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 取地黃、熟地黃樣品粉末約2.0g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,精密加入甲醇100 m L,稱定重量,加熱回流提取0.5 h,放冷,再稱定重量,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過(guò),精密量取續(xù)濾液50 m L,濃縮至近干,殘?jiān)恿鲃?dòng)相溶解,轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中,并用水稀釋 至刻度線,搖勻,用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾,取續(xù)濾液,即得。

表1 毛蕊花糖苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)果

分別取生地黃飲片、樣品S0、S1、S2、S3、S4、S5、S6、地黃個(gè)子、T0、T1、T2、T3、T4、T5、T6,按照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,每批平行3份,精密吸取各供試品溶液各20μL,注入高效液相色譜儀測(cè)定,記錄各峰面積,并以外標(biāo)法計(jì)算毛蕊花糖苷的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 生地黃、不同工藝熟地黃中毛蕊花糖苷含量測(cè)定結(jié)果

4 討論

本文所建立的毛蕊花糖苷含量測(cè)定方法是在參考2015版《中國(guó)藥典》中熟地黃【含量測(cè)定】項(xiàng)下方法的基礎(chǔ)上,結(jié)合實(shí)際情況適當(dāng)調(diào)整的結(jié)果,最終確定流動(dòng)相組成及比例為乙腈-0.1%乙酸水溶液(18∶82)。在該條件下,目標(biāo)成分與干擾成分可達(dá)到很好的分離效果[1,7-8]。

筆者對(duì)地黃蒸制過(guò)程中的相關(guān)因素進(jìn)行了系統(tǒng)研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),地黃經(jīng)炮制后毛蕊花糖苷的含量會(huì)發(fā)生明顯降低,但蒸制方式,即加壓和常壓蒸制對(duì)毛蕊花糖苷含量的影響沒(méi)有明顯差異,反倒是“回潤(rùn)”這一過(guò)程可導(dǎo)致毛蕊花糖苷含量降低；而不同的蒸制原料對(duì)毛蕊花糖苷含量的影響也具有一定差異,地黃飲片較個(gè)子在蒸制過(guò)程中毛蕊花糖苷含量隨時(shí)間下降的速率更慢。此外,地黃中毛蕊花糖苷的含量雖然隨著蒸制時(shí)間的延長(zhǎng)而降低,但實(shí)際上在蒸制到8 h之后毛蕊花糖苷含量的下降速率才開(kāi)始加快,而蒸制8 h與12 h的熟地黃在品相上無(wú)明顯差異。因此,從保證熟地黃中毛蕊花糖苷含量的角度來(lái)看,熟地黃的炮制方法以飲片直接蒸制8 h為佳。

從理論上講,地黃中的毛蕊花糖苷屬于苯乙醇苷類,其所含有的酯鍵可在蒸制過(guò)程中發(fā)生可逆的酯化反應(yīng)[9],即酸性條件下毛蕊花糖苷可水解發(fā)生酯鍵斷裂,生成咖啡酸和羥基絡(luò)醇[10],使毛蕊花糖苷的含量降低,這也是地黃在“回潤(rùn)”的過(guò)程中毛蕊花糖苷含量會(huì)發(fā)生下降的原因。同時(shí),這些中間產(chǎn)物又可在加熱的酸性條件下通過(guò)酯化反應(yīng)生成毛蕊花糖苷[11,12],從而彌補(bǔ)毛蕊花糖苷的損失,這也是為何地黃經(jīng)蒸制后隨時(shí)間變化,毛蕊花糖苷的含量沒(méi)有急劇降低的原因。此外,地黃飲片較地黃個(gè)子在蒸制過(guò)程中含量降低速率低,懷疑也與地黃飲片與環(huán)境接觸面積大、可逆反應(yīng)所需條件更充足有關(guān)。

綜上所述,為得到毛蕊花糖苷含量更高的熟地黃飲片炮制工藝,本文從理論和實(shí)踐上對(duì)地黃蒸制過(guò)程中的相關(guān)因素進(jìn)行了系統(tǒng)研究,并結(jié)合傳統(tǒng)工藝進(jìn)行綜合考量,認(rèn)為熟地黃的炮制方法以地黃飲片直接蒸制8 h更合理。