綠茶提取物EGCG對(duì)乙醇誘導(dǎo)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙的作用

楊海玉 劉勇 胡建新 戴艷枝 文麗丹

作者單位：330006 南昌，江西省人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所(楊海玉、文麗丹)、病理科(劉勇、戴艷枝)、藥劑科(胡建新)

大腦是乙醇(俗稱“酒精”)誘導(dǎo)損傷的最常見靶器官之一，長期大量飲酒可引起腦器質(zhì)性損害，并逐漸發(fā)展至癡呆狀態(tài)，稱之為乙醇性癡呆(alcohol-associated dementia，AAD)，臨床以學(xué)習(xí)記憶功能受損為其主要特征表現(xiàn)，嚴(yán)重者日常生活不能自理[1]。目前研究認(rèn)為乙醇對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響并不是作用于整個(gè)大腦，而是針對(duì)某些特定腦區(qū)，尤其是海馬結(jié)構(gòu)[2]。海馬是與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)的重要腦區(qū)，研究證實(shí)乙醇可通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎性反應(yīng)等途徑導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡，致使海馬區(qū)功能性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目減少，從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能障礙[3-4]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)是從綠茶中分離得到的兒茶素類單體，也是綠茶的主要活性成份。大量研究證實(shí)EGCG具有非常強(qiáng)的抗氧化活性，可抑制各種誘因?qū)е碌纳窠?jīng)元凋亡，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用[5-7]。另外，我們的前期工作也證實(shí)EGCG對(duì)乙醇誘導(dǎo)的SH-SY5Y神經(jīng)元細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用[8]。本研究通過建立AAD大鼠模型，以Morris水迷宮行為學(xué)檢測(cè)評(píng)價(jià)其學(xué)習(xí)記憶功能，并進(jìn)一步觀察大鼠海馬組織形態(tài)學(xué)和細(xì)胞凋亡改變，初步探討EGCG對(duì)乙醇誘導(dǎo)學(xué)習(xí)記憶功能障礙的作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6～8周齡雄性SD大鼠(180～220 g)，購自江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。

1.1.2主要試劑和儀器：EGCG購自成都曼思特生物科技有限公司，水合氯醛由江西省人民醫(yī)院藥劑科提供；Hoechst33342染色劑購自碧云天生物技術(shù)研究所，氧化應(yīng)激檢測(cè)試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；熒光實(shí)時(shí)定量PCR相關(guān)試劑購自美國Thermo Fisher公司。水迷宮設(shè)施由安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司提供。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與處理：實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組和EGCG組(n=15)，兩組動(dòng)物均按體質(zhì)量8 mL/(kg·d)給予20%(體積分?jǐn)?shù))乙醇灌胃持續(xù)28 d，建立AAD大鼠模型[9]。EGCG組在乙醇灌胃前1個(gè)月起給予EGCG(1 mg/mL)自由飲水至乙醇灌胃結(jié)束，對(duì)照組給予蒸餾水代替。

1.2.2Morris水迷宮行為學(xué)檢測(cè)[10]：各組大鼠在開始乙醇灌胃前和乙醇灌胃28 d后分別進(jìn)行Morris水迷宮行為學(xué)檢測(cè)。水迷宮設(shè)施為直徑150 cm圓形游泳池，劃分為四個(gè)象限，于第四象限中央放置一15 cm×10 cm×20 cm平臺(tái)，泳池內(nèi)灌水以沒過平臺(tái)1～2 cm為宜。檢測(cè)動(dòng)物從入水至尋找到平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期(escape latent，EL)，并以此作為衡量動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的主要指標(biāo)。由于平臺(tái)放置在第四象限，以第四象限路程/總路程百分比和第四象限時(shí)間/總時(shí)間百分比作為評(píng)價(jià)學(xué)習(xí)記憶能力的參考指標(biāo)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)束后撤去水下平臺(tái)，然后任選同一個(gè)入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中，計(jì)算其在60 s內(nèi)跨過平臺(tái)相應(yīng)位置的次數(shù)(穿臺(tái)次數(shù))，用于測(cè)量大鼠學(xué)會(huì)尋找平臺(tái)后對(duì)平臺(tái)空間位置記憶的保持能力。

1.2.3大鼠海馬組織形態(tài)觀察及神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測(cè)：Morris水迷宮行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后，各組取3只大鼠給予10 %(體積分?jǐn)?shù))水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)40 g/L多聚甲醛灌流后取全腦并以40 g/L多聚甲醛固定24 h，選取海馬部位切取厚度為2 mm腦片，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋，制作厚約4～6 μm的組織切片。

(1)大鼠海馬組織形態(tài)觀察：將切片進(jìn)行常規(guī)蘇木素-伊紅(Hematoxylin-Eosin，HE)染色，光鏡下觀察海馬組織形態(tài)學(xué)改變并取圖。

(2)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測(cè)：海馬區(qū)組織切片經(jīng)脫蠟、水化處理后用PBS洗3次，然后每張切片滴加適量Hoechst33342染色液覆蓋組織，避光染色10 min，PBS洗3次后封片，采用熒光顯微鏡觀察取圖。每只大鼠選取1張切片，在每張切片雙側(cè)海馬齒狀回隨機(jī)選取3個(gè)視野，并進(jìn)行凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)。凋亡細(xì)胞的特征表現(xiàn)為細(xì)胞核呈明顯固縮、濃染。

1.2.4大鼠海馬組織凋亡相關(guān)因子表達(dá)：本研究采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)凋亡因子B淋巴細(xì)胞瘤-2蛋白(B-cell lymphoma-2， BCL2)、BCL2-相關(guān)X蛋白(BCL2-associated X， BAX)基因在大鼠海馬組織中的表達(dá)變化(n=6)。引物序列設(shè)計(jì)如下：BCL2上游引物5′-GTACCTGAACCGGCATCTG-3′，下游引物5′-GGGGCCATATAGTTCCACAA-3′； BAX上游引物5′-GTGAGCGGCTGCTTGTCT-3′，下游引物5′-GTGGGGGTCCCGAAGTAG-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物5′-GGCCTTCCGTGTTCCTACC-3′，下游引物5′-CGCCTGCTTCACCACCTTC-3′。RNA提取后按試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，之后采用熒光定量PCR儀(美國ABI Step one plus Real time-PCR system)進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)步驟為：95°C變性15 s，60°C退火20 s，72°C延伸40 s，共40個(gè)循環(huán)；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理，計(jì)算過程如下：△CT目的基因=CT目的基因-CT同一樣本的內(nèi)參基因，△△CT目的基因=△CT實(shí)驗(yàn)組目的基因-△CT對(duì)照組目的基因，相對(duì)倍數(shù)(實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組)=2-ΔΔCT目的基因，所得結(jié)果為BCL2及BAX的相對(duì)表達(dá)量(即檢測(cè)目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的表達(dá)變化)。

1.2.5大鼠海馬組織氧化應(yīng)激相關(guān)酶活性檢測(cè)：各組大鼠斷頭處死(n=6)，分離新鮮海馬組織勻漿，之后4℃、3000 r/min離心10 min，提取上清液-80℃凍存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)方法按總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行。采用紫外分光光度計(jì)分別檢測(cè)T-SOD反應(yīng)液和GSH-Px反應(yīng)液(450 nm)的吸光度〔D(λ)〕值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算反應(yīng)液中的產(chǎn)物濃度；吸光度值越大，提示抗氧化酶活性越高。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Morris水迷宮行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果

如表1所示，對(duì)照組大鼠在乙醇灌胃后其EL時(shí)間明顯延長(t=2.474，P=0.035)、第四象限時(shí)間/總時(shí)間百分比(t=5.202，P=0.001)、第四象限路程/總路程百分比明顯下降(t=3.374，P=0.008)，提示其學(xué)習(xí)記憶功能在一定程度上受到乙醇損害。EGCG組大鼠的EL時(shí)間、第四象限時(shí)間/總時(shí)間及第四象限路程/總路程百分比在乙醇灌胃前后均無明顯改變(P>0.05)；并且與對(duì)照組相比，EGCG組大鼠在乙醇灌胃后其EL時(shí)間縮短、穿臺(tái)次數(shù)增加、第四象限路程/總路程百分比及第四象限時(shí)間/總時(shí)間百分比增高(均P<0.05)，提示其學(xué)習(xí)記憶功能損害得到明顯改善。

2.2大鼠海馬HE染色觀察結(jié)果對(duì)照組大鼠海馬區(qū)可見大量散在分布的異常細(xì)胞，胞核固縮變形、濃染，細(xì)胞密度減少(圖1A)；EGCG組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、完整，形態(tài)均一，細(xì)胞核未見異形、濃染等明顯異常改變(圖1B)。

2.3兩組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況比較對(duì)照組大鼠海馬區(qū)(圖2A)可見大量聚集分布的致密濃染凋亡細(xì)胞；而EGCG組大鼠海馬區(qū)僅見少量的濃染凋亡細(xì)胞(圖2B)。凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，EGCG組大鼠海馬區(qū)的凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.05；表2)。

表1 兩組大鼠Morris水迷宮行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果

注：與灌胃前相比，aP<0.05，aaP<0.01

注：A：對(duì)照組；B：EGCG組 圖1 兩組大鼠海馬區(qū)組織形態(tài)比較(HE×200) 注：A：對(duì)照組；B：EGCG組 圖2 大鼠海馬區(qū)凋亡染色結(jié)果(Hoechst33342免疫熒光×200)

表2 兩組大鼠海馬組織凋亡細(xì)胞、凋亡相關(guān)因子及氧化應(yīng)激相關(guān)酶活性比較

2.4兩組大鼠海馬組織凋亡相關(guān)因子表達(dá)及氧化應(yīng)激相關(guān)酶活性比較熒光實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，EGCG組大鼠海馬組織中抗凋亡因子BCL2的表達(dá)明顯增高，促凋亡因子BAX的表達(dá)明顯降低(均P<0.05)。與對(duì)照組比較，EGCG組大鼠海馬組織中抗氧化酶T-SOD、GSH-Px的酶活性均明顯增高(均P<0.05)。具體結(jié)果見表2。

3 討論

隨著社會(huì)生活方式的改變，飲酒已成為人們交際生活中越來越多的行為，由此帶來的健康問題亦受到越來越多的關(guān)注。AAD是慢性乙醇中毒最為嚴(yán)重的精神病狀態(tài)，也是長期大量飲酒引起腦器質(zhì)性損害的結(jié)果，臨床表現(xiàn)記憶力缺損伴其他認(rèn)知功能障礙為其主要特征。海馬是神經(jīng)元高度集中的部位，現(xiàn)有研究認(rèn)為海馬是調(diào)控學(xué)習(xí)記憶功能的關(guān)鍵腦區(qū)，在短時(shí)記憶轉(zhuǎn)為長時(shí)記憶以及空間航行定位功能中具有重要作用。目前已有大量研究證實(shí)長期慢性飲酒可促使海馬體積減小及海馬區(qū)大量神經(jīng)細(xì)胞凋亡。Oliveira-da-Silva等[3]對(duì)出生后30～45 d的C57BL/6小鼠給予腹腔注射乙醇發(fā)現(xiàn)，乙醇作用可導(dǎo)致海馬大部分區(qū)域(包括齒狀回顆粒層及分子層、CA1、CA2和CA3區(qū))的凋亡細(xì)胞數(shù)目增加，而且神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞密度明顯減少。本研究也同樣證實(shí)，28d乙醇灌胃可導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶功能損害，并明顯破壞其海馬組織結(jié)構(gòu)及誘導(dǎo)海馬神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生顯著凋亡。上述結(jié)果提示乙醇促進(jìn)海馬神經(jīng)元凋亡是其導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能損傷的重要機(jī)制。

然而，目前對(duì)于慢性乙醇中毒導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶功能障礙尚無有效的治療方法，主要是在戒酒治療同時(shí)予以B族維生素、胞二磷膽堿等神經(jīng)營養(yǎng)劑作為支持，而其治療效果并不理想。EGCG是從綠茶中分離得到的兒茶素類單體，它是綠茶主要的活性成份，在兒茶素中含量最高。早在古代醫(yī)書中就有關(guān)于茶葉解酒毒功效的記載?，F(xiàn)代研究證實(shí)EGCG具有非常強(qiáng)的抗氧化活性，不僅對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷具有保護(hù)作用，而且可明顯改善動(dòng)物學(xué)習(xí)認(rèn)知功能[5-7]。更為重要的是，有研究證實(shí)EGCG可明顯促進(jìn)成年動(dòng)物海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖和神經(jīng)元存活，并且可促使神經(jīng)干細(xì)胞向損傷區(qū)域遷移[11-13]。因此，本研究以AAD大鼠模型為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，初步探討綠茶提取物EGCG對(duì)酒精誘導(dǎo)學(xué)習(xí)記憶功能障礙的作用及機(jī)制。本研究結(jié)果表明，EGCG可明顯改善AAD大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，并可在一定程度上減輕乙醇導(dǎo)致的海馬形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞。本研究還觀察到，EGCG作用可明顯減少AAD大鼠海馬區(qū)的凋亡細(xì)胞數(shù)目，同時(shí)可上調(diào)抗凋亡因子BCL2表達(dá)及下調(diào)促凋亡因子BAX的表達(dá)，由此可見EGCG可通過抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路而發(fā)揮保護(hù)作用。另外，EGCG作用可增強(qiáng)大鼠海馬組織中抗氧化酶T-SOD和GSH-Px的酶活性，提示其也可通過抗氧化應(yīng)激而發(fā)揮對(duì)乙醇誘導(dǎo)海馬損傷的保護(hù)作用。

綜上所述，本研究結(jié)果提示EGCG對(duì)于乙醇誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶功能損傷具有一定的改善作用，其機(jī)制可能與抑制海馬神經(jīng)元凋亡和抗氧化應(yīng)激有關(guān)。由此可見EGCG對(duì)AAD臨床治療可能具有潛在的價(jià)值。