冬蟲(chóng)夏草生物學(xué)及生態(tài)學(xué)研究中的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題研究進(jìn)展

徐 夢(mèng),徐 明,2,*,李仁強(qiáng)

1 中國(guó)科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所生態(tài)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)觀測(cè)與模擬重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100101 2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院, 北京 100049

冬蟲(chóng)夏草是由線性蟲(chóng)草科(Ophiocordycipitaceae)的冬蟲(chóng)夏草菌(Ophiocordycepssinensis)侵染蝙蝠蛾科(Hepialidae)昆蟲(chóng)的幼蟲(chóng)而形成的幼蟲(chóng)尸體(菌核)與真菌子座的復(fù)合體[1- 2]。冬蟲(chóng)夏草是我國(guó)二級(jí)保護(hù)物種,主要分布在青海、西藏、四川、云南和甘肅五省(自治區(qū)),其中青海和西藏占全國(guó)冬蟲(chóng)夏草產(chǎn)量的80%以上。冬蟲(chóng)夏草含有多種生物活性物質(zhì),具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂等廣泛的藥理作用[3],是享譽(yù)中外的中、藏藥和食用菌中的珍品,與人參、鹿茸一起被尊為“中藥三寶”。目前冬蟲(chóng)夏草已成為藏區(qū)重要支柱產(chǎn)業(yè),對(duì)藏區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和民生穩(wěn)定有重要意義。近年來(lái)隨著市場(chǎng)對(duì)冬蟲(chóng)夏草的需求日益增加,天然冬蟲(chóng)夏草資源的減少已成為不爭(zhēng)的事實(shí)。一方面,冬蟲(chóng)夏草的形成過(guò)程復(fù)雜且循環(huán)周期漫長(zhǎng)[4],過(guò)度采挖極容易造成資源枯竭；另一方面,人類活動(dòng)及氣候變化造成的生境變化會(huì)影響冬蟲(chóng)夏草的發(fā)生發(fā)育過(guò)程,進(jìn)而造成冬蟲(chóng)夏草資源分布及產(chǎn)量變化。因此,如何維持天然冬蟲(chóng)夏草資源的可持續(xù)性發(fā)展,已成為生態(tài)學(xué)及物種保護(hù)研究中的熱點(diǎn)問(wèn)題[5]。

我國(guó)在冬蟲(chóng)夏草生物學(xué)及生態(tài)學(xué)研究中處于世界領(lǐng)先水平,在冬蟲(chóng)夏草的檢測(cè)和鑒定[6-8]、遺傳多樣性[9- 11]、冬蟲(chóng)夏草的生活史、生境及資源分布[4,12-13]以及冬蟲(chóng)夏草基因組研究[14-15]等方面取得了很多成果,冬蟲(chóng)夏草菌無(wú)性型培養(yǎng)、菌絲體深層發(fā)酵和寄主昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)的人工飼養(yǎng)等技術(shù)日益成熟[16-17]。通過(guò)建立研發(fā)生產(chǎn)基地、室內(nèi)模擬青藏高原氣候環(huán)境,李文佳等[18]實(shí)現(xiàn)了冬蟲(chóng)夏草的人工培植及產(chǎn)業(yè)化；廣東省昆蟲(chóng)研究所、中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園、中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所等機(jī)構(gòu)的科研人員成功的在寄主幼蟲(chóng)上培育出冬蟲(chóng)夏草子實(shí)體[17,19]。這些重要科研突破,為冬蟲(chóng)夏草人工培植及產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供了關(guān)鍵的理論和技術(shù)支撐。針對(duì)冬蟲(chóng)夏草及冬蟲(chóng)夏草菌在真菌分類學(xué)研究和中藥使用中長(zhǎng)期存在的名稱混用,即對(duì)真菌-寄主幼蟲(chóng)復(fù)合體和冬蟲(chóng)夏草菌并沒(méi)有嚴(yán)格區(qū)分,制定了冬蟲(chóng)夏草相關(guān)中英文科學(xué)術(shù)語(yǔ)的使用規(guī)范建議[4],例如“冬蟲(chóng)夏草(Chinese cordyceps)”指菌-蟲(chóng)復(fù)合體(中藥材使用部分),“冬蟲(chóng)夏草菌(Chinese caterpillar fungus或Chinese cordyceps fungus)”指形成冬蟲(chóng)夏草的真菌(O.sinensis)。此外,為系統(tǒng)總結(jié)冬蟲(chóng)夏草研究進(jìn)展,專著《冬蟲(chóng)夏草菌的生物學(xué)研究》[20]以及專刊(例如《菌物學(xué)報(bào)》2016年冬蟲(chóng)夏草?？?也已面世。這些研究成果為冬蟲(chóng)夏草物種保護(hù)、生態(tài)撫育和可持續(xù)利用夯實(shí)了基礎(chǔ)。不過(guò),目前在冬蟲(chóng)夏草生物學(xué)及生態(tài)學(xué)研究中還有一些關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題尚未十分明確,例如冬蟲(chóng)夏草菌侵染蝙蝠蛾幼蟲(chóng)的過(guò)程以及子實(shí)體發(fā)生發(fā)育的生物學(xué)機(jī)制、天然冬蟲(chóng)夏草與其微環(huán)境中微生物群落相互作用關(guān)系、全球變暖背景下未來(lái)青藏高原地區(qū)的氣候變化對(duì)冬蟲(chóng)夏草資源的影響等。本文對(duì)這些科學(xué)問(wèn)題的研究進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)和分析,并指出現(xiàn)有研究存在的不足,以期為進(jìn)一步開(kāi)展冬蟲(chóng)夏草生物學(xué)及生態(tài)學(xué)研究、實(shí)現(xiàn)冬蟲(chóng)夏草資源的可持續(xù)發(fā)展提供參考。

1 冬蟲(chóng)夏草菌侵染蝙蝠蛾幼蟲(chóng)的途徑及機(jī)理

作為典型的蟲(chóng)生真菌,冬蟲(chóng)夏草菌可以通過(guò)表皮侵染途徑感染寄主蝙蝠蛾幼蟲(chóng),其大致過(guò)程是：冬蟲(chóng)夏草菌(或中國(guó)被毛孢Hirsutellasinensis,冬蟲(chóng)夏草菌的無(wú)性型)的子囊孢子粘附在蝙蝠蛾幼蟲(chóng)的體壁節(jié)間皺折處后長(zhǎng)出微小芽管并侵染進(jìn)入寄主幼蟲(chóng)血體腔；芽管斷裂形成長(zhǎng)梭形的菌體并以頂端出芽的方式增殖分化,互相質(zhì)配；質(zhì)配菌體生長(zhǎng)出菌絲充滿寄主幼蟲(chóng)血體腔,破壞血淋巴系統(tǒng),致使幼蟲(chóng)的新陳代謝機(jī)能完全喪失而死[21- 22]。冬蟲(chóng)夏草菌的表皮侵染途徑主要發(fā)生在4—5齡幼蟲(chóng)剛蛻皮的時(shí)期,此時(shí)新嫩表皮極容易在進(jìn)食爬行過(guò)程中損傷,同時(shí)血淋巴蛋白量顯著降低[21],利于冬蟲(chóng)夏草菌寄生感染。并且,熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)冬蟲(chóng)夏草菌侵染貢嘎蝠蛾幼蟲(chóng)后類枯草桿菌蛋白酶基因表達(dá)量上調(diào)了2—3倍,說(shuō)明冬蟲(chóng)夏草菌能夠通過(guò)增加降解昆蟲(chóng)體壁的胞外蛋白酶的分泌進(jìn)行表皮侵染[23]。除了表皮侵染途徑,冬蟲(chóng)夏草還可能通過(guò)口腔攝入感染蝙蝠蛾幼蟲(chóng)[24]。這是由于冬蟲(chóng)夏草菌能夠粘附甚至定殖在蝙蝠蛾幼蟲(chóng)喜食的植物根系中[8,25],因此可以通過(guò)口器取食,從口腔經(jīng)消化道內(nèi)壁進(jìn)入昆蟲(chóng)體內(nèi)血腔這一途徑進(jìn)行侵染。雷桅等[26]采用qPCR測(cè)定了冬蟲(chóng)夏草菌在蝙蝠蛾幼蟲(chóng)表皮、脂肪體、血淋巴和腸壁的定殖量,構(gòu)建了起始于表皮及腸道這兩種侵染路徑的Holt模型,并推論冬蟲(chóng)夏草菌隨口腔攝食侵染寄主幼蟲(chóng)的方式具有一定合理性,不過(guò)其發(fā)生可能伴隨更多干擾因素。李文佳等[27]通過(guò)熒光染色顯微鏡檢發(fā)現(xiàn)蝙蝠蛾幼蟲(chóng)的消化道及嘔吐物中均存在與血淋巴中形態(tài)相同且狀態(tài)良好的冬蟲(chóng)夏草菌菌體,表明蝙蝠蛾幼蟲(chóng)腸道的生理環(huán)境可以維系并支撐冬蟲(chóng)夏草菌菌體某種形態(tài)的存在與生長(zhǎng)。目前學(xué)術(shù)界對(duì)表皮侵染和口腔攝入(腸道侵染)這兩種途徑究竟哪種才是冬蟲(chóng)夏草菌感染蝙蝠蛾幼蟲(chóng)的主導(dǎo)機(jī)制并未達(dá)成一致。天然冬蟲(chóng)夏草發(fā)生的土壤中定殖著大量的冬蟲(chóng)夏草菌[28],因此通過(guò)表皮感染蝙蝠蛾幼蟲(chóng)的機(jī)率較大,但是幼蟲(chóng)表皮的防護(hù)結(jié)構(gòu)和免疫攻擊也會(huì)限制冬蟲(chóng)夏草菌的入侵；而口腔取食途徑不僅受到植物根系帶菌豐度的影響,并且冬蟲(chóng)夏草菌在腸道內(nèi)的生存還受到腸道生理環(huán)境的影響。此外,采樣或觀測(cè)時(shí)期也會(huì)影響對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌侵染蝙蝠蛾幼蟲(chóng)的主導(dǎo)途徑的判斷。例如,Lei等[29]發(fā)現(xiàn)在冬季蝙蝠蛾幼蟲(chóng)休眠期,冬蟲(chóng)夏草菌主要存在于幼蟲(chóng)的表皮和脂肪體,在血淋巴和腸壁存在很少,說(shuō)明表皮侵染可能是這個(gè)時(shí)期的主要途徑。而在夏季蝙蝠蛾幼蟲(chóng)取食及生長(zhǎng)活躍期,Guo等[30]發(fā)現(xiàn)寄主蝙蝠蛾幼蟲(chóng)頭部的穩(wěn)定性碳同位素組成值明顯高于子座以及蟲(chóng)體其他部位,其原因可能是該部位真菌呼吸代謝作用較強(qiáng)而導(dǎo)致13C富集,由此推測(cè)頭部是真菌侵染的主要部位。由于迄今為止尚無(wú)法在自然狀態(tài)下觀測(cè)到冬蟲(chóng)夏草菌侵染蝙蝠蛾幼蟲(chóng)的過(guò)程,未來(lái)研究中急需開(kāi)發(fā)相應(yīng)的觀測(cè)設(shè)備及試驗(yàn)技術(shù),例如原位顯微攝影、穩(wěn)定性碳同位素核酸探針示蹤技術(shù)等,以有助于深入研究冬蟲(chóng)夏草菌感染蝙蝠蛾幼蟲(chóng)的途徑和機(jī)制。

2 冬蟲(chóng)夏草發(fā)生發(fā)育過(guò)程的調(diào)控因子

冬蟲(chóng)夏草的發(fā)生發(fā)育過(guò)程實(shí)質(zhì)上就是冬蟲(chóng)夏草菌侵染到寄主蝙蝠蛾幼蟲(chóng)后通過(guò)無(wú)性生殖過(guò)渡到有性生殖,從而完成其生活史的過(guò)程(圖1)。在夏季,冬蟲(chóng)夏草菌的菌絲或分生(或子囊)孢子通過(guò)表皮接觸或口器取食等途徑侵染適齡蝙蝠蛾幼蟲(chóng)后,以無(wú)性生殖方式在活蟲(chóng)體內(nèi)繁衍增殖,分解蟲(chóng)體內(nèi)部器官組織；隨著冬蟲(chóng)夏草菌逐漸充滿整個(gè)蟲(chóng)體體腔,蟲(chóng)體僵化程度越來(lái)越高,最終死亡；冬蟲(chóng)夏草菌在蟲(chóng)體形成菌核,而蟲(chóng)皮則形成一層堅(jiān)實(shí)的菌膜,能夠保護(hù)菌核克服漫長(zhǎng)寒冷的冬季環(huán)境的影響, 并使幼蟲(chóng)尸體(即“冬蟲(chóng)”)保持完好無(wú)損。在適宜的條件下,冬蟲(chóng)夏草菌的有性生殖方式啟動(dòng),在當(dāng)年土壤凍結(jié)前從蟲(chóng)體頭部長(zhǎng)出短小的子座芽(子座原基)；春末夏初,隨著環(huán)境溫度逐漸升高,冬蟲(chóng)夏草菌的子座繼續(xù)生長(zhǎng)并伸出土壤表面,形如小草,故名“夏草”。子座發(fā)育初期內(nèi)部充實(shí),后變中空,并且子座頭部(產(chǎn)生子囊殼部分)逐漸膨大。六月下旬至七月上旬,子囊孢子成熟并從子囊殼口彈射出來(lái),散落到土壤中,在適宜的條件下又去侵染其他的蝙蝠蛾幼蟲(chóng)[4]。

圖1 冬蟲(chóng)夏草菌及蝙蝠蛾生活史Fig.1 Life cycles of Ophiocordyceps sinensis and Hepialidae moth

冬蟲(chóng)夏草菌主要分布在青藏高原3000—5000 m的高寒地帶,對(duì)復(fù)雜多變的高寒生態(tài)系統(tǒng)的長(zhǎng)期適應(yīng)導(dǎo)致冬蟲(chóng)夏草菌的生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)溫度十分敏感。研究表明,冬蟲(chóng)夏草菌在室內(nèi)培養(yǎng)的最宜溫度為15—18℃,而在野外冬蟲(chóng)夏草菌生長(zhǎng)發(fā)育的適宜溫度為7—12℃[31- 32]。研究發(fā)現(xiàn),變溫條件對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌有性生殖階段的發(fā)生起到至關(guān)重要的作用：冬蟲(chóng)夏草菌的子座只有在經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的低溫(0—4℃)誘導(dǎo)后才能分化和形成[33- 34],這與植物的春化作用十分相似,然而調(diào)控這一過(guò)程的分子或者生化機(jī)制目前并不明確。另外,在低溫條件下,冬蟲(chóng)夏草菌能夠產(chǎn)生更多的無(wú)性分生孢子,這與分生孢子的抗逆性高于菌絲有關(guān)[35]。這些經(jīng)過(guò)低溫刺激而產(chǎn)生的大量分生孢子能夠?yàn)閷?lái)溫度適宜時(shí)萌發(fā)增殖提供一個(gè)良好的生物量基礎(chǔ)。

環(huán)境水分對(duì)冬蟲(chóng)夏草發(fā)生發(fā)育過(guò)程的影響主要發(fā)生在冬蟲(chóng)夏草菌侵染蝙蝠蛾幼蟲(chóng)及冬蟲(chóng)夏草菌子座(子實(shí)體)發(fā)育這兩個(gè)階段。適宜的土壤濕度有利于冬蟲(chóng)夏草菌子囊孢子及分生孢子萌發(fā)并侵染寄主蝙蝠蛾幼蟲(chóng)。尤其是在每年蝙蝠蛾幼蟲(chóng)的第二次蛻皮高峰期(7月中下旬到8月上中旬),此時(shí)冬蟲(chóng)夏草菌的子囊孢子也剛從成熟的子實(shí)體上彈射出,適宜的土壤的含水量(40%以上)有利于子囊孢子滲入土壤并萌發(fā),增加侵染蝙蝠蛾幼蟲(chóng)的幾率[36]。冬蟲(chóng)夏草子座的生長(zhǎng)發(fā)育需要較高的環(huán)境水分,最適的大氣相對(duì)濕度為80%—95%,此時(shí)子座生長(zhǎng)快速而肥大；當(dāng)大氣相對(duì)濕度低于70%時(shí),子座的生長(zhǎng)極慢甚至變干枯,從而無(wú)法完成正常的有性階段[31,37]。室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)也表明,冬蟲(chóng)夏草菌子實(shí)體正常生長(zhǎng)發(fā)育的最適大氣相對(duì)濕度為95%—100%,基質(zhì)含水量為60%—80%[33]。

光照對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌子座的分化形成幾乎沒(méi)有影響,但是顯著影響子座的露土[33]。光照的時(shí)間和強(qiáng)度能夠影響冬蟲(chóng)夏草菌子座的生長(zhǎng)速度、外部形態(tài)以及子囊的發(fā)育：光照強(qiáng),時(shí)間長(zhǎng),子座生長(zhǎng)緩慢但形體粗壯；光照弱或者照射時(shí)間不足導(dǎo)致子座徒長(zhǎng)而細(xì)長(zhǎng),甚至停止生長(zhǎng)；紫外線照射能夠抑制子座徒長(zhǎng),并提高子囊孢子的萌發(fā)率[38]。Yang等[39]發(fā)現(xiàn),可見(jiàn)光中的藍(lán)光波段(455—492 nm)能夠誘導(dǎo)冬蟲(chóng)夏草菌中WC- 1藍(lán)光受體蛋白含量顯著上升,而WC- 1受體蛋白可能在調(diào)控冬蟲(chóng)夏草菌有性發(fā)育及代謝過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用[40]。在自然環(huán)境出土的冬蟲(chóng)夏草,往往呈現(xiàn)出幼蟲(chóng)尸體頭部接近土壤表層,蟲(chóng)體幾乎垂直于(或稍傾斜)土壤表面向下的狀態(tài),但是目前并不清楚天然冬蟲(chóng)夏草形成這種狀態(tài)的原因。涂勇勤等[33]認(rèn)為子座具有向光性生長(zhǎng)的特性,因此僵化前的幼蟲(chóng)會(huì)借助土壤中微弱的光線爬行到近土表1—3 cm處, 將頭向上然后僵化, 以有利于子座出土。這個(gè)理論雖然能從一定程度上解釋冬蟲(chóng)夏草呈現(xiàn)這種狀態(tài)的原因,但是仍然需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。首先,自然條件下冬蟲(chóng)夏草菌無(wú)性型向有性型的轉(zhuǎn)化以及子座的分化形成的時(shí)間是在寄主幼蟲(chóng)僵化之前還是之后,目前并沒(méi)有明確。其次,被感染的蝙蝠蛾幼蟲(chóng)向地表爬行是一種自主行為還是受到冬蟲(chóng)夏草菌的調(diào)控？如果是受到冬蟲(chóng)夏草菌的調(diào)控,那么是通過(guò)何種信號(hào)物質(zhì)(例如某種光受體蛋白)來(lái)達(dá)成的？這種信號(hào)物質(zhì)又是如何調(diào)控被感染幼蟲(chóng)的肌肉活動(dòng)？這些問(wèn)題在未來(lái)對(duì)冬蟲(chóng)夏草發(fā)生發(fā)育過(guò)程的研究中需要更多的關(guān)注。

在自然環(huán)境中,土壤是冬蟲(chóng)夏草發(fā)生發(fā)育的主要場(chǎng)所。土壤環(huán)境對(duì)冬蟲(chóng)夏草發(fā)生發(fā)育的影響主要表現(xiàn)在：(1)直接或通過(guò)植物(即蝙蝠蛾幼蟲(chóng)的食物資源)間接影響寄主幼蟲(chóng)的活動(dòng)、生長(zhǎng)發(fā)育及種群數(shù)量；(2)通過(guò)影響被感染幼蟲(chóng)的環(huán)境條件而直接影響冬蟲(chóng)夏草菌增殖、子座的分化與生長(zhǎng)、子囊殼的形成與成熟、子囊孢子的彈射等[31]。土壤是由固、液、氣三態(tài)物質(zhì)組成的復(fù)雜生態(tài)環(huán)境,除了溫度、濕度條件,其他土壤因素也可能對(duì)冬蟲(chóng)夏草的發(fā)生發(fā)育過(guò)程有重要影響。例如,在自然環(huán)境下冬蟲(chóng)夏草多發(fā)生在高原草甸黑褐壤土中,其土壤微團(tuán)聚體間的聯(lián)結(jié)比較疏松,有空隙性,透水好,有機(jī)質(zhì)含量高,土壤pH為5.0—6.5,呈微酸性[12]；土壤速效氮以及鉀、磷等元素的含量能夠影響冬蟲(chóng)夏草種群數(shù)量,但其影響程度隨土壤深度而變化[41- 42]；冬蟲(chóng)夏草發(fā)生環(huán)境中的微生物群落[43- 44]及植物激素等生物因素[45]也可能對(duì)冬蟲(chóng)夏草的發(fā)生發(fā)育過(guò)程產(chǎn)生一定影響。上述這些環(huán)境因子在冬蟲(chóng)夏草的發(fā)生發(fā)育的哪個(gè)過(guò)程或階段中發(fā)揮何種影響作用,還需要進(jìn)一步研究以明確調(diào)控發(fā)生發(fā)育各階段的主導(dǎo)因子。并且,在土壤這樣一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境中,各個(gè)因子幾乎不可能單獨(dú)影響冬蟲(chóng)夏草的發(fā)生發(fā)育過(guò)程,因此必需考慮土壤因子對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌感染蝙蝠蛾幼蟲(chóng)及冬蟲(chóng)夏草菌有性生活史的綜合影響,這也正是冬蟲(chóng)夏草生態(tài)學(xué)未來(lái)需要重點(diǎn)研究的問(wèn)題。

3 冬蟲(chóng)夏草菌的遺傳多樣性和基因組學(xué)研究

冬蟲(chóng)夏草分布地區(qū)地形和氣候的差異性導(dǎo)致冬蟲(chóng)夏草菌的遺傳和分化表現(xiàn)出明顯的地理分布差異。對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌遺傳多樣性已經(jīng)開(kāi)展了多年的研究工作,早期使用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)[46]以及簡(jiǎn)單序列重復(fù)間區(qū)擴(kuò)增多態(tài)性(ISSR)[47- 48]分析揭示了不同冬蟲(chóng)夏草地理群體間存在遺傳分化,并推測(cè)冬蟲(chóng)夏草群體的遺傳分化主要發(fā)生于南北方向,表現(xiàn)在不同緯度間。近年來(lái),使用一些DNA片段例如核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA-ITS)、交配型基因(MAT1-2-1)等作為分子標(biāo)識(shí)物,除了揭示冬蟲(chóng)夏草的遺傳多樣性,還為冬蟲(chóng)夏草菌的起源和擴(kuò)散[9]、與寄主昆蟲(chóng)協(xié)同進(jìn)化關(guān)系[10- 11,49]等問(wèn)題提供了科學(xué)依據(jù)。研究表明,冬蟲(chóng)夏草菌的遺傳分化程度隨緯度梯度增加而增大,并且西藏南部(尤其是林芝地區(qū))種群的遺傳多樣性最高,很可能是冬蟲(chóng)夏草菌的起源中心[9]；基于分子鐘和生物地理演化分析的結(jié)果推測(cè),冬蟲(chóng)夏草菌可能在約2.26千萬(wàn)年前起源于西藏南部地區(qū),之后不斷向青藏高原其他地區(qū)擴(kuò)散并伴隨著多種進(jìn)化事件的發(fā)生[49]。不過(guò),Quan等[10]發(fā)現(xiàn)冬蟲(chóng)夏草菌在香格里拉地區(qū)(隸屬于橫斷山脈地區(qū))的遺傳分化程度高于林芝地區(qū),可能是冬蟲(chóng)夏草遺傳多樣性的起源中心。袁峰[50]報(bào)道了冬蟲(chóng)夏草種群ITS單倍型首次分化發(fā)生在橫斷山區(qū),并隨著青藏高原不同部位的隆升順序進(jìn)行遷移：一部分種群從橫斷山區(qū)向青藏高原東部擴(kuò)散到達(dá)現(xiàn)在的青海、甘肅一帶,而另一部分種群則向青藏高原內(nèi)部(主要是西藏地區(qū))遷移。盡管目前對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌的起源地沒(méi)有達(dá)成統(tǒng)一認(rèn)識(shí),但不可否認(rèn)的是青藏高原地質(zhì)活動(dòng)是造成和加劇冬蟲(chóng)夏草菌遺傳分化的主要因素,尤其是西藏南部以及橫斷山區(qū)的地形地貌導(dǎo)致了嚴(yán)重的地理隔離,使得冬蟲(chóng)夏草種群的遺傳分化在這一地區(qū)的遺傳分化尤為劇烈。

最近,冬蟲(chóng)夏草的基因組學(xué)研究有了重大的突破,為從基因水平上解析冬蟲(chóng)夏草菌群體遺傳分化、生態(tài)適應(yīng)性等研究夯實(shí)了基礎(chǔ)。Xia等[14]采用全基因組鳥(niǎo)槍法測(cè)序,獲得了相對(duì)完整且高質(zhì)量的冬蟲(chóng)夏草菌參考基因組圖譜,并注釋得到了7939個(gè)蛋白編碼基因。該研究發(fā)現(xiàn),在約3.8千萬(wàn)年前隨著青藏高原的抬升,冬蟲(chóng)夏草菌LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子發(fā)生急速擴(kuò)增,導(dǎo)致冬蟲(chóng)夏草菌基因組相比于其他低海拔近緣物種(如蛹蟲(chóng)草等)擴(kuò)張了3.4倍；冬蟲(chóng)夏草基因組中與運(yùn)輸過(guò)程和能量代謝相關(guān)的蛋白編碼基因大量丟失,而與抗低溫密切相關(guān)的功能基因則大量擴(kuò)增,這些特性都可能是冬蟲(chóng)夏草菌對(duì)高海拔寒冷和極端復(fù)雜的環(huán)境變化的重要響應(yīng)。Kang 等[51]采用單分子實(shí)時(shí)測(cè)序(SMRT sequencing)分析了冬蟲(chóng)夏草菌線粒體基因組的表觀修飾模式,發(fā)現(xiàn)冬蟲(chóng)夏草菌線粒體DNA甲基化修飾在蛋白編碼基因(PCG)的編碼區(qū)和非編碼區(qū)均有發(fā)生,從而影響氧化磷酸化過(guò)程相關(guān)酶活性導(dǎo)致線粒體呼吸速率降低,或者影響線粒體的生物合成過(guò)程,這些特性很可能有助于冬蟲(chóng)夏草菌適應(yīng)高海拔寒冷以及低氧分壓環(huán)境。除了生態(tài)適應(yīng)性,基因組學(xué)的研究還能為真菌致病性提供科學(xué)依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn),冬蟲(chóng)夏草菌中表皮降解蛋白酶(類枯草桿菌蛋白酶、胰蛋白酶等)的編碼基因雖然顯著少于其他昆蟲(chóng)病原菌[52],但其所分泌的蛋白酶對(duì)特定寄主表皮的降解卻更加高效[14],并且表皮降解蛋白酶編碼基因的減少也可能是冬蟲(chóng)夏草菌為了躲避寄主昆蟲(chóng)免疫系統(tǒng)的檢測(cè)從而進(jìn)化出的防御機(jī)制[53]。此外,冬蟲(chóng)夏草菌中與真菌致病性相關(guān)的基因或基因家族(例如,過(guò)氧化物酶活性基因、絲氨酸水解酶編碼基因、重金屬蛋白酶基因、細(xì)胞色素P450 基因和葡萄糖-甲醇-膽堿氧化還原酶等)發(fā)生了特異性的顯著擴(kuò)增[14]。Zhong等[54]對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌RNA測(cè)序發(fā)現(xiàn),侵染蝙蝠蛾幼蟲(chóng)后冬蟲(chóng)夏草菌中與真菌毒素(mycotoxin)相關(guān)的基因(例如Asp-haemolysin)表達(dá)顯著上調(diào),可能是導(dǎo)致寄主昆蟲(chóng)緩慢死亡的原因[55]；侵染蝙蝠蛾幼蟲(chóng)后S-抗原蛋白和過(guò)敏源Asp相關(guān)基因表達(dá)顯著下調(diào),由于這些蛋白能夠引起機(jī)體免疫反應(yīng)并產(chǎn)生抗體,因此冬蟲(chóng)夏草很可能通過(guò)下調(diào)相關(guān)基因編碼以避免誘發(fā)寄主昆蟲(chóng)的免疫攻擊。目前對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌的組學(xué)研究(基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組)極大的擴(kuò)充了科研人員對(duì)冬蟲(chóng)夏草生物學(xué)和生態(tài)學(xué)的認(rèn)知,尤其是人工培植技術(shù)的實(shí)現(xiàn),為通過(guò)組學(xué)研究冬蟲(chóng)夏草菌特異性侵染機(jī)制、子實(shí)體發(fā)育等關(guān)鍵過(guò)程提供了有力的條件。未來(lái)研究除了提高測(cè)序深度和精度,還可以結(jié)合基因工程技術(shù),進(jìn)一步驗(yàn)證相關(guān)基因?qū)Χx(chóng)夏草菌致病性以及生態(tài)適應(yīng)性中發(fā)揮的作用。

4 天然冬蟲(chóng)夏草及其微環(huán)境中的微生物群落

在自然環(huán)境下,冬蟲(chóng)夏草的發(fā)生發(fā)育過(guò)程由冬蟲(chóng)夏草菌主導(dǎo),同時(shí)也會(huì)伴隨著多種微生物的生長(zhǎng)。因此,梁宗琦等[56]提出,應(yīng)當(dāng)把野生冬蟲(chóng)夏草作為“一個(gè)統(tǒng)一的微生物生態(tài)系統(tǒng)”來(lái)進(jìn)行研究。許多研究結(jié)果都表明,天然冬蟲(chóng)夏草及其生長(zhǎng)的微環(huán)境內(nèi)具有較高的微生物多樣性[43- 44,57-58]。張永杰等[57]使用常規(guī)分離培養(yǎng)方法,從天然冬蟲(chóng)夏草的子座、菌核和菌膜3個(gè)部位共分離到572個(gè)真菌菌株。這些菌株根據(jù)形態(tài)鑒定屬于37個(gè)不同的屬,根據(jù)nrDNA-ITS序列的相似性分為 92 個(gè)OTU；分離自子座的優(yōu)勢(shì)真菌是產(chǎn)黃青霉(Penicilliumchrysogenum),而分離自菌核和菌膜的優(yōu)勢(shì)真菌均為玫紅假裸囊菌(Pseudogymnoascusroseus)。Xia等[58]使用高通量測(cè)序分析了天然冬蟲(chóng)夏草子實(shí)體、菌膜及其蟲(chóng)體周圍土壤的真菌多樣性,發(fā)現(xiàn)線性蟲(chóng)草屬(Ophiocordyceps)是天然冬蟲(chóng)夏草子座及菌膜中的優(yōu)勢(shì)屬,并且子座及菌膜中的微生物群落結(jié)構(gòu)與蟲(chóng)體周圍的土壤微生物群落有顯著差別。冬蟲(chóng)夏草菌與及其他寄生在蝙蝠蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)的微生物的相互作用關(guān)系不僅可能影響到寄主幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)及生理活性,也可能是冬蟲(chóng)夏草發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制之一。朱佳石等[59]發(fā)現(xiàn)蝙蝠蛾擬青霉(Paecilomyceshepiali)和冬蟲(chóng)夏草菌共同存在于天然冬蟲(chóng)夏草中,并伴隨其成熟過(guò)程發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。并且,利用P.hepiali兩個(gè)分離菌株與H.sinensis分生孢子聯(lián)合侵染蝙蝠蛾幼蟲(chóng)可大幅提高其感染效能,說(shuō)明多菌協(xié)同侵染作用可能是冬蟲(chóng)夏草發(fā)生的重要環(huán)節(jié)[60]。然而,從天然冬蟲(chóng)夏草中分離得到的P.hepiali菌株卻在平板對(duì)峙試驗(yàn)中對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌產(chǎn)生了明顯較強(qiáng)的抑制作用,說(shuō)明其在寄主蝙蝠蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)可能與冬蟲(chóng)夏草菌存在營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)的關(guān)系[61]。由此可見(jiàn),冬蟲(chóng)夏草菌與寄生在蝙蝠蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)的其他微生物群落的相互作用關(guān)系十分復(fù)雜,急需深入展開(kāi)相關(guān)研究。由于共同寄生在同一微環(huán)境中的微生物群落往往能形成趨同的代謝成分和藥理作用,從天然冬蟲(chóng)夏草中分離出的其他真菌資源是開(kāi)發(fā)創(chuàng)新藥物非常重要的生物來(lái)源[4],因此值得深入探索和研究。此外,定殖在天然冬蟲(chóng)夏草內(nèi)的細(xì)菌群落多樣性也十分豐富[43- 44],但是這些細(xì)菌群落與冬蟲(chóng)夏草菌的相互作用關(guān)系、對(duì)冬蟲(chóng)夏草的子實(shí)體形成發(fā)育以及藥理作用的影響仍然需要進(jìn)一步研究。

5 未來(lái)氣候變化對(duì)冬蟲(chóng)夏草資源分布及產(chǎn)量的影響

青藏高原作為“世界屋脊”,是全球氣候變化最為敏感的區(qū)域之一。根據(jù)氣象學(xué)家的觀測(cè)結(jié)果,青藏高原的氣候變化相對(duì)全球來(lái)看具有5年以上的超前變化趨勢(shì)[62],主要表現(xiàn)在氣溫升高速率顯著高于中國(guó)和世界其他地區(qū),以及降水總量在時(shí)間及空間上的不均勻分布。由于冬蟲(chóng)夏草菌和蝙蝠蛾都是長(zhǎng)期適應(yīng)高寒生態(tài)系統(tǒng)的物種,氣候變化必將對(duì)冬蟲(chóng)夏草的分布格局及資源量產(chǎn)生一定影響。據(jù)采集冬蟲(chóng)夏草的牧民反映,近年來(lái)冬蟲(chóng)夏草的分布區(qū)域有隨海拔升高的趨勢(shì),并且逐漸由草甸向灌叢移動(dòng),而在低海拔地區(qū)的低洼處則出現(xiàn)了多個(gè)冬蟲(chóng)夏草聚集在一起產(chǎn)生的“蟲(chóng)草窩”。楊大榮[63]考察發(fā)現(xiàn),目前冬蟲(chóng)夏草主要產(chǎn)區(qū)的核心分布帶位于海拔4400—4700 m,較30年前上升200—500 m,并且明顯變狹窄。通過(guò)對(duì)青藏高原二十多座雪山連續(xù)多年觀測(cè)的結(jié)果表明,冬蟲(chóng)夏草表現(xiàn)出明顯的兩極分布格局：個(gè)體大的冬蟲(chóng)夏草(干草>0.4 g/條)的分布上移到海拔4600 m以上,而個(gè)體小的冬蟲(chóng)夏草(干草<0.25 g/條)則下移到海拔3900 m以下的高山櫟林及冷杉林中[12]。造成這種兩極分布格局的原因目前尚未明確,可能是由于：(1)蝙蝠蛾種群的生物地理分布具有垂直地帶性[36],而不同蝙蝠蛾物種的幼蟲(chóng)個(gè)體大小可能存在差異；(2)蝙蝠蛾幼蟲(chóng)自身個(gè)體大小可能受到海拔變化(主要是溫度變化)的影響,高海拔低溫環(huán)境導(dǎo)致蝙蝠蛾幼蟲(chóng)發(fā)育速率降低、生長(zhǎng)周期變長(zhǎng)[31],因此體內(nèi)可能積累更多的脂肪、糖類等抗寒及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而導(dǎo)致體型較大；不過(guò),以上的推測(cè)還需要進(jìn)一步通過(guò)試驗(yàn)手段來(lái)驗(yàn)證。目前對(duì)氣候變化如何影響冬蟲(chóng)夏草發(fā)生發(fā)育相關(guān)過(guò)程的研究還相當(dāng)薄弱,十分必要開(kāi)展野外原位控制試驗(yàn)結(jié)合室內(nèi)模擬培養(yǎng),以揭示氣候變化對(duì)冬蟲(chóng)夏草資源分布的影響及其機(jī)制。

由于冬蟲(chóng)夏草多生長(zhǎng)在海拔較高、地形復(fù)雜、人跡罕至的惡劣環(huán)境中,僅通過(guò)野外采樣和入戶調(diào)查得到的結(jié)果很難全面、準(zhǔn)確的反映出冬蟲(chóng)夏草資源分布及氣候變化對(duì)其的影響。利用地理信息系統(tǒng)(GIS)的空間分析功能以及物種分布的棲息地模型(例如最大熵模型MaxEnt)則能夠克服采樣調(diào)查的限制性,并且能夠從一定程度上預(yù)測(cè)氣候變化對(duì)冬蟲(chóng)夏草資源分布及產(chǎn)量的影響[64- 67]。基于遙感和GIS分析,朱壽東等[66]利用雪線高程、采收期(4—5月)的平均氣溫、降水量和日照時(shí)長(zhǎng)等環(huán)境因子和冬蟲(chóng)夏草產(chǎn)量之間的關(guān)系,建立加權(quán)幾何平均模型,可以在每年的6月上旬預(yù)測(cè)當(dāng)年的冬蟲(chóng)夏草產(chǎn)量,其預(yù)測(cè)精度可達(dá)82%以上。Yan等[67]運(yùn)用最大熵(MaxEnt)、廣義可加模型(GAM)等6種方法構(gòu)建了不同氣候變化情景模式下冬蟲(chóng)夏草菌分布區(qū)域的預(yù)測(cè)模型。結(jié)果表明,在RCP 2.6和RCP 8.5這兩種氣候變化情景模式下,至2050年冬蟲(chóng)夏草菌分布范圍的凈變化為減少17.7%—18.5%,其中海拔4000—4500 m內(nèi)冬蟲(chóng)夏草菌分布區(qū)域減少最為顯著,而分布增加的海拔范圍主要在4500—5000 m之間。這一結(jié)果與野外調(diào)查的結(jié)論基本相吻合,說(shuō)明利用模型研究氣候變化對(duì)冬蟲(chóng)夏草資源分布的影響可信度較高。相比于基于生態(tài)因子對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌或蝙蝠蛾的影響進(jìn)行預(yù)測(cè),基于冬蟲(chóng)夏草發(fā)生發(fā)育過(guò)程構(gòu)建的機(jī)理模型可能更加準(zhǔn)確反映出冬蟲(chóng)夏草資源數(shù)量的變化。Woodall等[68]構(gòu)建了一個(gè)廣義寄主-病原菌機(jī)理模型并預(yù)測(cè)了不同收獲方式對(duì)蟲(chóng)生真菌(例如蟲(chóng)草)產(chǎn)量的影響,發(fā)現(xiàn)定期收獲部分成熟蟲(chóng)草有利于維持總產(chǎn)量的穩(wěn)定性。未來(lái)研究可以考慮在這個(gè)機(jī)理模型的基礎(chǔ)上加入環(huán)境因子成分以預(yù)測(cè)氣候變化對(duì)冬蟲(chóng)夏草產(chǎn)量的影響。此外,在自然生境下冬蟲(chóng)夏草菌-蝙蝠蛾幼蟲(chóng)-植物三者之間構(gòu)成了一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定且平衡的小型生態(tài)系統(tǒng)[4],因此還應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注氣候變化對(duì)這三者之間相互作用關(guān)系的影響,并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建機(jī)理模型,才能更加準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)青藏高原氣候變化對(duì)冬蟲(chóng)夏草的資源分布與產(chǎn)量的影響。

6 結(jié)論與展望

冬蟲(chóng)夏草作為一種具有極高藥用和食用價(jià)值的珍稀菌類,其生物學(xué)特性和可持續(xù)發(fā)展關(guān)鍵技術(shù)一直是研究熱點(diǎn)。我國(guó)對(duì)冬蟲(chóng)夏草的研究由于天時(shí)和地利,一直處于世界領(lǐng)先水平,但是仍然有一些關(guān)鍵的科學(xué)問(wèn)題尚未十分明確,從而嚴(yán)重制約了冬蟲(chóng)夏草資源的合理利用及保護(hù)政策制定。本文系統(tǒng)總結(jié)了冬蟲(chóng)夏草生物學(xué)和生態(tài)學(xué)研究中幾個(gè)關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題的研究進(jìn)展,包括冬蟲(chóng)夏草發(fā)生發(fā)育過(guò)程及其調(diào)控因子、冬蟲(chóng)夏草菌遺傳多樣性及組學(xué)研究、天然冬蟲(chóng)夏草及其微環(huán)境中的微生物群落、氣候變化對(duì)冬蟲(chóng)夏草資源的影響等,并分析指出了現(xiàn)有研究中的不足。鑒于冬蟲(chóng)夏草生物學(xué)和生態(tài)學(xué)研究面臨的機(jī)遇和挑戰(zhàn),建議應(yīng)盡快圍繞以下幾個(gè)方面開(kāi)展研究工作。(1)利用先進(jìn)的或研發(fā)觀測(cè)儀器及相關(guān)技術(shù),以實(shí)現(xiàn)冬蟲(chóng)夏草菌侵染蝙蝠蛾幼蟲(chóng)途徑、冬蟲(chóng)夏草菌子實(shí)體發(fā)生發(fā)育過(guò)程的原位觀測(cè)研究。(2)利用分子生物學(xué)、穩(wěn)定性同位素、組學(xué)研究等最新技術(shù)及方法,明確冬蟲(chóng)夏草菌對(duì)寄主蝙蝠蛾幼蟲(chóng)特異性侵染的生物學(xué)機(jī)制,探索天然冬蟲(chóng)夏草及其微環(huán)境中與冬蟲(chóng)夏草菌共存的其他土壤真菌和細(xì)菌群落,并分析它們的相互作用關(guān)系及對(duì)冬蟲(chóng)夏草發(fā)生發(fā)育的影響。(3)利用人工培植技術(shù),通過(guò)室內(nèi)模擬明確各生態(tài)因子在冬蟲(chóng)夏草發(fā)生發(fā)育各個(gè)階段的調(diào)控作用,確定冬蟲(chóng)夏草發(fā)生發(fā)育關(guān)鍵階段的主要調(diào)控因子,為冬蟲(chóng)夏草半人工培植提供科學(xué)依據(jù)。(4)在冬蟲(chóng)夏草產(chǎn)區(qū)建立蟲(chóng)草保護(hù)區(qū)及科學(xué)研究基地,通過(guò)長(zhǎng)期原位觀測(cè)及模擬試驗(yàn),明確氣候變化和人類活動(dòng)對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌、蝙蝠蛾及其采食植物,以及它們之間的相互關(guān)系的影響,并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建機(jī)理模型,以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)全球變暖背景下未來(lái)青藏高原環(huán)境變化對(duì)冬蟲(chóng)夏草的資源分布與產(chǎn)量的影響。