高遷移率族蛋白1在蛛網(wǎng)膜下腔出血腦血管痙攣病人外周血中的表達及臨床意義

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腦血管痙攣(cerebral vasospasm，CVS)是自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血(aneurysmalsubarachnoid hemorrhage，SAH)最常見、最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，其最常見于動脈瘤破裂后3 d～10 d，可導(dǎo)致痙攣動脈供血區(qū)域腦血流(cerebral blood flow，CBF)減少，造成腦遲發(fā)缺血性神經(jīng)功能惡化當(dāng)其不能有效控制，或持續(xù)時間較長，最終會導(dǎo)致腦梗死的發(fā)生，所以CVS是蛛網(wǎng)膜下腔出血病人致殘、致死的重要原因[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，SAH后的CVS發(fā)病機制與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[3]，而高遷移率族蛋白1(high-mobility group box 1，HMGB-1)作為新發(fā)現(xiàn)的一種晚期炎癥介質(zhì)及致炎因子，廣泛參與了關(guān)節(jié)炎、膿毒血癥、失血性休克、缺血再灌注損傷等多種炎癥病理過程[4]。本研究通過檢測HMGB-1的表達情況，初步探討HMGB-1在SAH后CVS中的臨床意義，進而為其生理病理機制的研究提供新的思路及依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我科2014年1月—2017年6月收治的經(jīng)診斷證實的自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血，并且Hunt-Hess分級為Ⅰ～Ⅲ級的病人，SAH的診斷與治療依據(jù)美國心臟學(xué)會/美國卒中學(xué)會診療指南進行。CVS的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]：①SAH發(fā)病后5～14 d內(nèi)出現(xiàn)局灶性神經(jīng)功能缺損或者意識能力下降；②CT平掃排除顱內(nèi)再出血或者腦積水；③排除導(dǎo)致神經(jīng)功能下降的其他因素；④經(jīng)顱多普勒超聲(TCD)檢測血流速度：大腦中動脈(MCA)>200 cm/s，大腦前動脈(ACA)≥120 cm/s，大腦后動脈(PCA)>90 cm/s。此外，排除免疫系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重感染，血液疾病，惡性腫瘤及嚴(yán)重肝、腎功能不全病人。本研究經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有納入病人均簽署知情同意書。

1.2 HMGB-1的檢測

1.2.1 主要儀器與試劑 超凈臺購自蘇潔凈化設(shè)備公司；酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad 公司；離心機(Eppendorf Centrifuge 5417 R)購自德國Eppendorf公司；HMGB-1 ELISA檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2.2 ELISA法檢測血清HMGB-1水平 蛛網(wǎng)膜下腔出血病人均于入院12 h之內(nèi)留取外周血3 mL，同時收集病人1 d～10 d的新鮮外周血，3 000 r/min離心10 min，收集上清液，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。按照ELISA檢測試劑盒說明書檢測病人血清HMGB-1的水平。操作完成后用酶標(biāo)儀在450 nm波長處檢測待測樣品的吸光度值(OD值)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依照標(biāo)準(zhǔn)曲線測量樣品數(shù)值從而得出樣品含量。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料比較 按照納入排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入病人65例。根據(jù)其隨后是否發(fā)生腦血管痙攣分為CVS組(20例)及Non-CVS組(45例)，兩組病人年齡、性別、吸煙史、高血壓病史、發(fā)病至治療時間等差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

2.2 不同蛛網(wǎng)膜下腔出血病人血清HMGB-1表達的動態(tài)變化情況 分別隔天監(jiān)測了Non-CVS及CVS組病人入院后第1天～第11天外周血HMGB-1的表達水平，結(jié)果顯示不同組病人HMGB-1水平均在第5天～第7天達到高峰，隨后開始下降，且CVS組病人外周血HMGB-1表達高峰時間長于Non-CVS組。詳見圖1。

表1 自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血病人

圖1不同組別蛛網(wǎng)膜下腔出血病人外周血HMGB-1表達的動態(tài)變化情況

2.3 蛛網(wǎng)膜下腔出血病人血清HMGB-1表達與Hunt-Hess分級的關(guān)系 蛛網(wǎng)膜下腔出血病人血清中HMGB-1表達水平與Hunt-Hess分級呈明顯正相關(guān)(r=0.670 7，P<0.00 01)。

2.4 蛛網(wǎng)膜下腔出血病人血清HMGB-1表達與Fisher分級的關(guān)系 蛛網(wǎng)膜下腔出血病人血清中HMGB-1表達水平與Fisher分級呈顯著正相關(guān)(r=0.740 7，P<0.00 01)。

3 討 論

近年來，大量的研究發(fā)現(xiàn)SAH以及CVS很大程度上是由于炎癥因子的致炎作用。SAH后蛛網(wǎng)膜下腔產(chǎn)生多種炎性介質(zhì)，如細胞因子、黏附分子、補體等。此外，在對CVS血管壁的研究中發(fā)現(xiàn)，在管壁中層有大量免疫球蛋白IgG和補體C3沉積，且沉積量與CVS的嚴(yán)重程度呈顯著正相關(guān)[6]。隨后的臨床及動物實驗中均發(fā)現(xiàn)相比正常腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)，SAH后CSF中白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)及腫瘤壞死因子α(TNF-α)等多種重要的炎癥因子均有所升高，且水平越高預(yù)后越差[7]。

HMGB是一類存在于哺乳動物的核蛋白家族，包括HMGB-1、HMGB-2及HMGB-3 ，其中HMGB-1廣泛分布于真核細胞內(nèi)。通常當(dāng)機體內(nèi)環(huán)境處于穩(wěn)態(tài)時，HMGB-1存在于細胞核中，當(dāng)受到外界刺激打破平衡時，HMGB-1 的賴氨酸殘基乙?；筢尫诺桨?，再通過一系列下游的作用開始發(fā)揮致炎作用[8]，是參與整個炎癥過程的關(guān)鍵介質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，HMGB-1能夠促進內(nèi)皮細胞釋放細胞間黏附分子及TNF-α、白細胞介素-8(IL-8)等多種細胞因子表達[9]。在炎癥過程中，HMGB-1與RAGE、TLR2或TLR4結(jié)合，再通過MAPK及Erk1/2等信號通路激活核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)，從而能夠調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄過程，釋放大量趨化因子和細胞因子，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，同時釋放的細胞因子又可導(dǎo)致HMGB-1的進一步釋放，形成正反饋通路，最終產(chǎn)生炎癥的“級聯(lián)瀑布”效應(yīng)[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，相比沒有發(fā)生CVS的SAH病人，CVS病人血清HMGB-1表達明顯升高，而通過對HMGB-1的動態(tài)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，CVS組病人外周血HMGB-1表達高峰時間長于Non-CVS組，進一步研究發(fā)現(xiàn)，SAH病人HMGB1的表達與Hunt-Hess分級及Fisher分級均呈顯著正相關(guān)關(guān)系。以上研究結(jié)果表明，HMGB-1的過表達不僅可能導(dǎo)致SAH病人出現(xiàn)CVS，且HMGB-1的表達過高與SAH病人的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。與本研究結(jié)果相似，Murakami等[11]通過兔SAH實驗?zāi)Ｐ桶l(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，SAH組腦干組織在造模第5天 HMGB-1的基因水平增加5倍以上，表明SAH可以明顯上調(diào)促炎因子HMGB-1的表達，從而造成腦損傷。Nakahara等[12]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)病3 d、7 d、14 d SAH病人CSF中HMGB-1水平是影響SAH病人發(fā)生腦血管痙攣及預(yù)后的一個重要的獨立危險因素。

綜上所述，SAH后發(fā)生CVS的病人HMGB-1表達升高，且與病情的嚴(yán)重程度相關(guān)，提示HMGB-1可作為判斷SAH預(yù)后及CVS發(fā)生率的特異性生物學(xué)標(biāo)志物。此外，HMGB-1作為一種重要的炎癥介質(zhì)，參與腦損傷及腦血管痙攣的病理生理過程。因此，可以通過抗體或藥物抑制HMGB-1，減輕炎癥反應(yīng)，降低腦血管痙攣的發(fā)生率，從而改善SAH病人的預(yù)后，為SAH的治療提供了新的思路。