SERS結(jié)合PCA-LDA分析鑒別雞肉中硝基呋喃類代謝物的混合殘留

郭紅青 劉木華 袁海超 趙進(jìn)輝 陶進(jìn)江 陳 健 徐 寧

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，江西 南昌 330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物光電及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045)

1974年，F(xiàn)leischmann等[5]從吸附在粗糙銀電極表面的吡啶上發(fā)現(xiàn)了表面增強(qiáng)拉曼散射(Surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)效應(yīng)。SERS技術(shù)是基于被測(cè)樣品吸附在納米溶膠顆粒表面，使其SERS信號(hào)強(qiáng)度比普通拉曼信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)104～106倍，與普通拉曼光譜相比，具有極強(qiáng)的拉曼散射增強(qiáng)效應(yīng)[6-7]。張璐濤等[8]應(yīng)用SERS光譜法實(shí)現(xiàn)了蜂蜜中的金霉素殘留檢測(cè)，實(shí)際樣本中金霉素加標(biāo)回收率均為80%～120%。陳陽等[9]利用SERS光譜法結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法和支持向量回歸(SVR)實(shí)現(xiàn)了芘與菲溶液的定量分析。主成分分析法(Principle component analysis，PCA)是一種將可能有相關(guān)性的一些變量通過線性變換轉(zhuǎn)換為相對(duì)獨(dú)立的變量的方法，在保留原始數(shù)據(jù)有效信息的前提下，降低數(shù)據(jù)的維數(shù)，且變量的總方差維持不變[10-12]。線性判別分析(Linear discriminant analysis，LDA)是通過降低不同物質(zhì)類別內(nèi)方差比例，擴(kuò)大不同類別物質(zhì)間的差異，以實(shí)現(xiàn)較高的判別正確率，使用線性判別分析可以得到數(shù)據(jù)的最佳分類特征[13-14]。張芳等[15]采用紅外光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法(PCA-LDA)實(shí)現(xiàn)對(duì)道地山藥和非道地山藥的有效判別，準(zhǔn)確率分別為97.53%，98.88%。

試驗(yàn)擬通過簡(jiǎn)單的前處理方法對(duì)雞肉樣品中的AMOZ和AHD進(jìn)行提取，然后利用SERS法結(jié)合PCA-LDA鑒別雞肉中AMOZ和AHD殘留類別(即無AMOZ和AHD殘留、AMOZ殘留、AHD殘留和AMOZ+AHD殘留共4類)，為動(dòng)物源性食品中多抗生素殘留鑒別提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三黃雞：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；

四氯金酸三水合物：金含量≥49.0%，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；

AHD標(biāo)準(zhǔn)品(純度約為99.3%)、AMOZ標(biāo)準(zhǔn)品(純度約為99.5%)：購于中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)；

無水甲醇、乙腈、氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸三鈉、氯化鈉等：分析純，南昌精科科學(xué)儀器有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速組織攪碎機(jī)：DS-1型，上海標(biāo)本模型廠；

便攜式拉曼光譜檢測(cè)系統(tǒng)：包括計(jì)算機(jī)，海洋光學(xué)有限公司提供的QE65000型拉曼光譜儀、785 nm激光器、光纖及樣品池等；

超聲波清洗器：JK-50B型，合肥金尼克機(jī)械有限公司；

萬用電磁爐：?jiǎn)温?lián)型，北京科技永興儀器有限公司；

低速離心機(jī)：JW-1024型，安徽嘉文儀器裝備有限公司；

漩渦混合器：VORTEX-5型，海門市其林貝爾儀器有限公司；

石英進(jìn)樣瓶：直徑11.5 mm，高30 mm，北京瑞盛博源科技發(fā)展有限公司。

1.3 樣品制備

1.3.1 AMOZ或AHD標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制 稱取適量AMOZ或AHD標(biāo)準(zhǔn)品于容量瓶中，用超純水溶解并定容，配成100 mg/L的AMOZ或AHD標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-4 ℃ 避光存放備用。

1.3.2 AMOZ+AHD混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制 稱取適量AMOZ和AHD標(biāo)準(zhǔn)品于容量瓶中，用超純水并溶解定容，配成AMOZ+AHD混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-4 ℃避光存放備用。

1.3.3 雞肉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備提取液的制備 取5.0 g攪碎的雞肉樣品，加入20 mL甲醇—水混合溶液(1∶1，體積比)，渦旋振動(dòng)3 min，超聲10 min，4 000 r/min離心10 min，棄上清液重復(fù)水洗1次，加入1 mol/L鹽酸0.5 mL 于殘留物中渦旋1 min加入AMOZ(或AHD、AMOZ+AHD)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液20 mL，并渦旋1 min或不進(jìn)行此操作(雞肉空白提取液的制備)，加入乙腈10 mL和1 mol/L 氫氧化鈉0.5 mL，渦旋振動(dòng)3 min，超聲10 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液，殘留物再用10 mL乙腈重復(fù)提取1次，合并兩次上清液，取10 mL提取液60 ℃ 水浴氮吹至近干，用適量超純水定容，經(jīng)0.45 μm有機(jī)相濾膜過濾，備用。通過該制備流程可分別得到含AMOZ或AHD的雞肉標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備提取液、雞肉提取液混合加標(biāo)儲(chǔ)備液和雞肉空白提取液。

1.3.4 不同濃度的AMOZ和AHD雞肉提取液的制備

用雞肉空白提取液將加標(biāo)雞肉提取液儲(chǔ)備液稀釋成不同濃度的混合工作溶液。

1.3.5 納米Au溶膠的制備 根據(jù)文獻(xiàn)[16]修改如下：加熱0.01%氯金酸溶液(100 mL)至沸騰后，迅速加入 0.5%檸檬酸三鈉溶液1.0 mL，并用玻璃棒攪拌加熱10 min后，冷卻到室溫備用。

1.4 光譜測(cè)量

便攜式拉曼光譜檢測(cè)系統(tǒng)參數(shù)設(shè)置：根據(jù)文獻(xiàn)[17]略作修改。785 nm激光器選擇激光光源功率520 mW；拉曼光譜儀分辨率6 cm-1，平均信號(hào)強(qiáng)度0～60 000 au；采集光譜波段0～3 000 cm-1，平滑度1，積分時(shí)間10 s，積分2次，取平均值；選取拉曼光譜波段400～1 800 cm-1的光譜進(jìn)行分析。

對(duì)雞肉提取液進(jìn)行拉曼光譜采集，根據(jù)文獻(xiàn)[17]修改如下：將0.9 mL納米Au溶膠、50 μL待測(cè)雞肉提取液、100 μL NaCl溶液依次加入到2 mL石英進(jìn)樣瓶中，混合均勻后，放入樣品池中采集其在吸附時(shí)間為0.5 min時(shí)的SERS光譜。

1.5 模型構(gòu)建

1.5.1 樣品預(yù)處理 先采用自適應(yīng)迭代懲罰最小二乘法消除背景干擾，使用Matlab 2010軟件進(jìn)行操作；再對(duì)拉曼光譜強(qiáng)度進(jìn)行最大值標(biāo)準(zhǔn)歸一化預(yù)處理，將樣品數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)歸一化，使用軟件The Unscrambler X 10.1進(jìn)行操作。

1.5.2 PCA分析 采用PCA對(duì)預(yù)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，提取特征變量，使用軟件The Unscrambler X 10.1進(jìn)行操作。

1.5.3 LDA分析 使用The Unscrambler X 10.1軟件進(jìn)行LDA分析?？倶颖緮?shù)280個(gè)，隨機(jī)選取3/4的樣本(210個(gè)樣本)作為校正集樣本[18]，建立判別模型；其余70個(gè)樣本作為預(yù)測(cè)集樣本，用分類正確率(即模型預(yù)測(cè)正確的樣本數(shù)與總樣本個(gè)數(shù)之比)來驗(yàn)證判別模型的有效性。將含AHD的雞肉提取液樣品、含AMOZ的雞肉提取液樣品、含AHD+AMOZ的雞肉提取液樣品、雞肉空白提取液樣品依次標(biāo)記為1～4，進(jìn)行模型識(shí)別。其中，含AHD的雞肉提取液樣品中AHD濃度為0.5～25.0 mg/L，含AMOZ的雞肉提取液樣品中AMOZ濃度為0.2～25.0 mg/L，含AHD+AMOZ的雞肉提取液樣品中AHD和AMOZ濃度分別為1.0～25.0，0.5～25.0 mg/L，雞肉空白提取液樣品不含AHD和AMOZ。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞肉樣本的SERS光譜

由圖1可知，通過單峰無法直接將雞肉中殘留的AMOZ和AHD類別分辨出來。

2.2 雞肉中AHD和AMOZ殘留的主成分提取

通過試驗(yàn)可知，前3個(gè)主成分對(duì)雞肉中AHD和AMOZ殘留的光譜數(shù)據(jù)的貢獻(xiàn)率分別為57.77%，37.62%，3.31%，累計(jì)貢獻(xiàn)率分別為57.77%，95.39%，98.70%；隨著主成分?jǐn)?shù)目的增加，主成分的貢獻(xiàn)率越來越小，其中PC1貢獻(xiàn)率最大，為57.77%；當(dāng)主成分?jǐn)?shù)目為3時(shí)，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)98.70%，表明前3個(gè)主成分因子可代表原始數(shù)據(jù)信息中的大部分有效信息，在保證檢測(cè)有效性的基礎(chǔ)上，很大程度上消除了較多無用信息，提高了檢測(cè)分析效率[19-20]。因此，選擇前3個(gè)主成分繪制得分圖。

a.納米金膠 b.納米金膠+氯化鈉 c.雞肉提取液 d.含AMOZ的雞肉提取液 e.含AHD的雞肉提取液 f.含AMOZ+AHD的雞肉提取液

圖1 SERS光譜圖

Figure 1 The spectra of SERS

2.3 主成分得分

由圖2可知，雞肉提取液中只含AHD的樣品絕大部分都分布在X軸、Y軸的正半軸及Z軸負(fù)半軸部分；雞肉提取液中只含AMOZ的樣品都聚集在一起，基本都在YZ平面；雞肉空白提取液樣品產(chǎn)生團(tuán)簇現(xiàn)象，基本集中在XZ平面與YZ平面的交界處；而雞肉提取液中含AHD和AMOZ兩種代謝物的樣品出現(xiàn)了分離現(xiàn)象，一部分與雞肉提取液中只含AHD的樣品重合，一部分與雞肉提取液中只含AMOZ的樣品重合，說明含AHD和AMOZ的雞肉提取液樣品的拉曼峰中不僅有只含AHD的雞肉提取液樣品的拉曼峰，還有只含AMOZ的雞肉提取液樣品的拉曼峰。從圖2可以看出，應(yīng)用主成分分析方法可以有效地鑒別出雞肉提取液中是否含有AHD，是否含有AMOZ，但不能有效鑒別出含AHD和AMOZ的雞肉提取液樣品。

空心圓表示含AHD的雞肉提取液；五角星表示含AMOZ的雞肉提取液；三角形表示含AHD+AMOZ的雞肉提取液；加號(hào)表示雞肉空白提取液

圖2 主成分得分三維散點(diǎn)圖

Figure 2 3D scatter plot of PCA scores

2.4 模型及預(yù)測(cè)結(jié)果

由表1可知，在建立的模型中雞肉空白提取液樣本的校正集和預(yù)測(cè)集的判別正確率都達(dá)到了100%；只含AHD的雞肉提取液樣品的校正集的判別正確率為96.67%，預(yù)測(cè)集的判別正確率為100%；含AHD和AMOZ的雞肉提取液樣品的校正集的判別正確率為89.33%，預(yù)測(cè)集的判別正確率為96%；而只含AMOZ的雞肉提取液樣品的校正集的正確識(shí)別率較低，為63.33%，預(yù)測(cè)集的識(shí)別率為70%，可能是雞肉中只含AMOZ時(shí)的拉曼峰會(huì)與雞肉中同時(shí)含AHD和AMOZ時(shí)的拉曼峰有重合。

結(jié)合圖2和表1可知，雞肉中分別只含AHD和AMOZ的樣品的主成分得分散點(diǎn)圖均與雞肉中同時(shí)含AHD和AMOZ的樣品的得分散點(diǎn)圖有部分重合，當(dāng)模型識(shí)別時(shí)，很可能會(huì)將只含AHD的和只含AMOZ的樣品被認(rèn)為是雞肉中同時(shí)含AHD和AMOZ的樣品。但總體而言，模型校正集的判別正確率為90.48%，預(yù)測(cè)集的正確率為94.29%。故應(yīng)用PCA-LDA建立的模型能有效識(shí)別雞肉提取液中是否含AHD和AMOZ，且可以鑒別出雞肉中AHD和AMOZ殘留的類別。

表1 主成分—線性判別模型的結(jié)果

3 結(jié)論

試驗(yàn)以納米Au溶膠和NaCl溶液為活性增強(qiáng)基底，應(yīng)用SERS技術(shù)結(jié)合PCA-LDA對(duì)雞肉中AHD和AMOZ殘留進(jìn)行識(shí)別分類。對(duì)雞肉中AHD和AMOZ殘留的4類樣品建立的模型中，校正集的判別正確率為63.33%～100.00%，總的判別正確率為90.48%；預(yù)測(cè)集的判別正確率為70.00%～100.00%，總的判別正確率達(dá)到了94.29%。試驗(yàn)結(jié)果表明，與液相色譜、氣相色譜等傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，應(yīng)用PCA-LDA能快速鑒別出雞肉中AHD和AMOZ殘留的類別，是雞肉中抗生素殘留快速檢測(cè)的發(fā)展趨勢(shì)。后期可采用非加標(biāo)樣本來完善預(yù)測(cè)模型，進(jìn)而為雞肉中的其他抗生素殘留快速檢測(cè)的實(shí)現(xiàn)提供重要理論依據(jù)。