阿魏酸及其烷基酯在水包油乳液中抗氧化效率的假相模型解釋

黃師榮 萬 慧 顏思念 陳東方

(湘潭大學(xué)生物與食品工程系，湖南 湘潭 411105)

食品中的脂類氧化會(huì)產(chǎn)生腐臭味和異味，降低保質(zhì)期，改變食品質(zhì)地和外觀，降低食品的營養(yǎng)價(jià)值和安全性，是食品腐敗變質(zhì)的原因之一[1]。食品乳液(如牛奶、蛋黃醬、調(diào)味品、醬汁、飲料、冰淇淋等)由于表面積更高，比油脂更容易被氧化[2-3]。目前，降低脂類氧化的最有效、最方便和最經(jīng)濟(jì)的方法是添加天然或合成抗氧化劑[1]。

酚酸在自然界廣泛存在，由于能阻止或延緩體外或體內(nèi)氧化過程，被廣泛用作新型的天然抗氧化劑[4]。但是酚酸極性較高，易于在水相優(yōu)先聚集，遠(yuǎn)離脂肪氧化發(fā)生的油/水界面，限制了其在乳化體系中的應(yīng)用[5]。為此，近年來有人[6]對其進(jìn)行了酯化修飾，以增強(qiáng)其疏水性，使其能更好地定位于氧化反應(yīng)發(fā)生的油水界面，從而改善其在乳化體系中的抗氧化性能和效率。然而，許多研究[1,7-10]表明用不同鏈長的正烷基醇酯化的酚酸在乳液中的抗氧化效率會(huì)隨著其疏水性增加而達(dá)到最大，進(jìn)一步增加其疏水性則其抗氧化效率顯著降低，表現(xiàn)出所謂的“截止效應(yīng)”。對于其背后的原因依舊不太清楚。Costa等[10]用假相動(dòng)力學(xué)模型解釋了咖啡酸及其烷基酯(C1～C16)隨著疏水性增加抗氧化效率達(dá)最大值的原因，還發(fā)現(xiàn)咖啡酸及其烷基酯的抗氧化效率與其在乳液界面區(qū)域的百分?jǐn)?shù)相對應(yīng)。在其他條件都相同的情況下，乳液界面區(qū)域中百分?jǐn)?shù)最大的抗氧化劑其效率最高。

為驗(yàn)證這一模型的適用性，試驗(yàn)擬研究與咖啡酸結(jié)構(gòu)比較類似的阿魏酸(FA)及其烷基酯在均相甲醇溶液中和菜籽油乳液中的抗氧化效率。用假相動(dòng)力學(xué)模型測定和計(jì)算FA及其烷基酯在乳液界面中的分布，旨在為特定乳液體系確定最有效的抗氧化劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿魏酸(純度97%)、對甲基苯磺酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.0%)、對十六烷基苯胺(純度97%)、亞硝酸叔丁酯(純度90%)、三氟化硼乙醚(純度98%)、鹽酸萘乙二胺(分析純)、正十二醇(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98.0%)：上海麥克林生化科技有限公司；

Trolox：純度97%，美國Sigma公司；

DPPH：純度96%，日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社；

分子篩、硅膠(200～300目)、活性炭(200目)：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

其他試劑均為市售分析純；

菜籽油：湘潭大學(xué)工會(huì)購物中心。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計(jì)：Agilent Cary60型，安捷倫科技(中國)有限公司；

pH計(jì)：PHS-3BW型，上海般特儀器有限公司；

三用紫外分析儀：ZF-7型，上海杰涵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

高速分散均質(zhì)機(jī)：FJ-2000型，上海標(biāo)本儀器廠；

核磁共振波譜儀：AVANCE III HD 400MHZ型，瑞士布魯克公司；

傅里葉紅外光譜儀：NICOLET 380型，美國尼高力公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 阿魏酸烷基酯的合成及表征 參考Sorensen等[11]的方法，稍作修改，其合成路線如圖1所示。將15.4 mmol 阿魏酸溶解于150 mL四氫呋喃(THF)中。將醇以1 mol阿魏酸與3 mol醇的摩爾比添加到阿魏酸的THF溶液中，再加入濃硫酸(最終體積分?jǐn)?shù)為5%)做催化劑，最后加入40 mg/mL的分子篩以除去反應(yīng)中產(chǎn)生的水分。將反應(yīng)物置于震蕩器中，在250 r/min，55 ℃的條件下避光反應(yīng)5～7 d。反應(yīng)結(jié)束后，除去分子篩，蒸發(fā)THF，并將反應(yīng)混合物在乙酸乙酯中稀釋。將所得溶液用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaHCO3溶液和水洗滌數(shù)次并用硫酸鈉干燥以除去痕量的水。然后，通過快速色譜法(以二氯甲烷和乙酸乙酯做洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫)去除剩余的醇和阿魏酸。

圖1 幾種阿魏酸烷基酯的合成路線

所得產(chǎn)物分別用TLC、1HNMR、FTIR進(jìn)行表征。

1.3.2 DPPH自由基清除能力測定 參考Claudia等[12]的方法進(jìn)行，稍作修改。用甲醇做溶劑分別配制濃度為150 μmol/L的DPPH溶液和濃度為600 μmol/L的6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox)溶液，然后將Trolox溶液再稀釋成濃度分別為250，200，150，100，50 μmol/L 的溶液。分別取0.5 mL Trolox稀釋液和4.5 mL DPPH甲醇溶液混合，振搖，置于暗處120 min后，用甲醇做空白，在515 nm處測吸光度。以Trolox濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線斜率記為k1。取FA及其烷基酯樣品代替Trolox試劑，同上步驟，建立以樣品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線斜率記為k2。樣品的DPPH自由基清除能力(ARA)以Trolox當(dāng)量(mol Trolox/mol)表示，按式(1)計(jì)算。重復(fù)測定3次，結(jié)果取平均值。

ARA=k2/k1。

(1)

1.3.3 阿魏酸及其烷基酯對水包油乳液抗氧化效率的測定 參考李進(jìn)等[13]的方法。

1.3.4 無乳化劑下阿魏酸及其烷基酯在油相和水相之間分配常數(shù)的測定 參照文獻(xiàn)[14]的方法。按式(2)計(jì)算抗氧化劑在油相和水相之間的分配常數(shù)值。

(2)

(3)

(4)

式中：

%AOO、%AOW——分別為抗氧化劑在油相和水相的摩爾分?jǐn)?shù)；

VW、VO——分別為水相和油相的體積，L；

(AOO)、(AOI)、(AOW)——分別為油相區(qū)、界面區(qū)和水相區(qū)中AO的摩爾濃度，mol/L。

ln(At-Ainf)=-kobst+ln(A0-Ainf)，

(5)

式中：

kobs——表觀速率常數(shù)，s-1；

A0、At——分別為樣品在0和t時(shí)刻的吸光度；

Ainf——樣品反應(yīng)完全時(shí)的吸光度。

(6)

式中：

kI——界面區(qū)域中二級(jí)速率常數(shù)，L/(mol·s)；

[]——乳液中各物質(zhì)的濃度，mol/L；

下標(biāo)T——總量；

下標(biāo)O、I和W——分別為油相區(qū)、界面區(qū)和水相區(qū)；

Φ——某個(gè)區(qū)域的體積分?jǐn)?shù)。

(7)

(8)

(9)

(10)

(11)

1.3.7 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包、OriginPro 8和Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果表示為：平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)以Duncans檢驗(yàn)方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿魏酸烷基酯的合成及結(jié)構(gòu)表征

阿魏酸乙酯(FA-C2)1H NMR(400 MHz，Acetone-d6)，δ：7.59(d，J=15.9 Hz，1H)，7.34(d，J=2.0 Hz，1H)，7.14(dd，J=8.2，2.0 Hz，1H)，6.88(d，J=8.2 Hz，1H)，6.39(d，J=15.9 Hz，1H)，4.19(q，J=7.1 Hz，2H)，3.92(s，3H)，1.28(t，J=7.1 Hz，3H)。FTIR ν：3 405，2 980，2 842，1 703，1 632，1 603，1 514，1 429，1 270，1 178，1 034，847，818 cm-1。

阿魏酸丁酯(FA-C4)1H NMR(400 MHz，Acetone-d6)，δ：7.60(d，J=15.9 Hz，1H)，7.33(d，J=2.0 Hz，1H)，7.14(dd，J=8.2，2.0 Hz，1H)，6.88(d，J=8.2 Hz，1H)，6.40(d，J=15.9 Hz，1H)，4.15(t，J=6.6 Hz，2H)，3.92(s，3H)，1.66(ddt，J=8.9，7.8，6.4 Hz，2H)，1.51～1.29(m，2H)，0.95(t，J=7.4 Hz，3H)。FTIR ν：3 405，2 955，2 875，1 700，1 630，1 599，1 516，1 455，1 269，1 170，1 032，848，817 cm-1。

阿魏酸辛酯(FA-C8)1H NMR(400 MHz，Acetone-d6)，δ：7.60(d，J=16.0 Hz，1H)，7.34(d，J=2.0 Hz，1H)，7.14(dd，J=8.2，2.0 Hz，1H)，6.87(d，J=8.1 Hz，1H)，6.40(d，J=15.9 Hz，1H)，4.15(t，J=6.7 Hz，2H)，3.93(s，3H)，1.79～1.62(m，2H)，1.51～1.17(m，10H)，0.88(d,J=7.0 Hz, 3H)。FTIR ν：3 417，2 930，2 857，1 704，1 629，1 598，1 513，1 458，1 269，1 168，1 031，848，817 cm-1。

阿魏酸十二酯(FA-C12)1H NMR(400 MHz, Acetone-d6)，δ：8.11(s，1H)，7.50(d，J=15.9 Hz，1H)，7.26(d，J=1.9 Hz，1H)，7.05(dd，J=8.2，2.0 Hz，1H)，6.78(d，J=8.2 Hz，1H)，6.31(d，J=15.9 Hz，1H)，4.05(t，J=6.7 Hz，2H)，3.83(s, 3H)，1.59(p，J=6.7 Hz，2H)，1.44～1.00(m, 18H)，0.78(t，J=6.6 Hz，3H)。FTIR ν：3 402，2 928，2 856，1 703，1 630，1 594，1 514，1 460，1 265，1 163，1 031，847，818 cm-1。

將上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17-18]數(shù)據(jù)進(jìn)行對比，確認(rèn)所得產(chǎn)物分別為阿魏酸乙酯、丁酯、辛酯和十二酯。

2.2 DPPH自由基清除能力

表1給出了FA及其烷基酯在均相甲醇溶液中的抗氧化效率。由表1可以看出，F(xiàn)A及其烷基酯的DPPH自由基清除能力大小順序?yàn)镕A>FA-C12>FA-C8>FA-C4≈FA-C2。FA表現(xiàn)出比其烷基酯更強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，表明FA的酯化降低了其清除自由基的能力。S?rensen等[11]在用DPPH自由基清除法研究阿魏酸酯的抗氧化性能時(shí)也得到相似的結(jié)果。據(jù)報(bào)道[19]，在能夠與酚類分子形成強(qiáng)氫鍵的極性溶劑例如甲醇或乙醇中，抗氧化劑主要通過提供電子來清除自由基。烷基屬于弱供電基團(tuán)，并且烷基鏈長越長，其供電性越強(qiáng)。因此酚酸及其烷基酯的自由基清除活性一般隨烷基鏈長的增加而增強(qiáng)；但FA烷基酯的自由基清除能力卻下降了，其原因有待進(jìn)一步研究。

表1 阿魏酸及其烷基酯的DPPH自由基清除能力?

? 字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 阿魏酸及其烷基酯在水包油乳液中的抗氧化效率

20世紀(jì)80年代，Porter提出了極性悖論假說，試圖根據(jù)抗氧化劑在不同脂類介質(zhì)中的極性預(yù)測抗氧化劑的效率。該假說認(rèn)為，抗氧化劑在不同脂類介質(zhì)中的抗氧化效力不同，極性抗氧化劑在極性更低的介質(zhì)如油脂中更有效，而非極性抗氧化劑在極性更高的介質(zhì)如水包油乳液或脂質(zhì)體中更有效[20]。為驗(yàn)證這一假說，研究了FA及其烷基酯(添加濃度為0.004 mol/L)對油與水體積比為2∶8的水包菜籽油乳液中脂質(zhì)的抗氧化效率，通過CD值達(dá)到1所用的時(shí)間和AV值的變化趨勢來評(píng)價(jià)FA及其烷基酯對水包油乳液的抗氧化效率，結(jié)果分別如圖2、3所示。由圖2、3可知，F(xiàn)A烷基酯對乳液的抗氧化作用顯著大于FA的，并且隨著FA烷基酯鏈的增長，其抗氧化作用逐漸增大，在FA-C8達(dá)到最大之后，隨著FA烷基酯鏈的進(jìn)一步增長，其抗氧化作用減小。這一結(jié)果與上述假說并不相符，Costa等[10]在研究咖啡酸及其酯對水包橄欖油乳液的抗氧化效率時(shí)也得到類似的結(jié)果。Barreiro等[1]認(rèn)為，酚酸烷基酯的抗氧化活性隨著鏈長增加觀察到最大值的根本原因是抗氧化劑在界面區(qū)的濃度不同。

圖2 不同體積分?jǐn)?shù)吐溫20制備的菜籽油乳液中共軛二烯值隨時(shí)間的變化

圖3 不同體積分?jǐn)?shù)吐溫20制備的菜籽油乳液中p-茴香胺值(AV)隨時(shí)間的變化

從圖2、3還可以看出，隨著吐溫20的體積分?jǐn)?shù)從1.0% 增加到4.0%，添加阿魏酸辛酯的乳液的CD值達(dá)到1所用的時(shí)間分別為51，48，46，43 d；AV值達(dá)到6所用的時(shí)間分別為40，38，35，31 d，表明隨著乳化劑體積分?jǐn)?shù)的增加其抗氧化性能下降了。當(dāng)吐溫20體積分?jǐn)?shù)從1.0% 增加到4.0%時(shí)，其體積增加了3倍，即界面區(qū)域增加了3倍，但FA-C8在界面區(qū)域的質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅由95%增加到99%(見圖5)，幾乎沒有變化。因而，F(xiàn)A-C8在乳液界面區(qū)域的平均摩爾濃度下降了。這可能是FA-C8的抗氧化效率隨吐溫20體積分?jǐn)?shù)增加而下降的原因。Costa等[10]在研究咖啡酸及其烷基酯對橄欖油乳液的抗氧化效率與其在乳液界面區(qū)域濃度的關(guān)系時(shí)也得到類似的結(jié)果。此外，隨著乳化劑體積分?jǐn)?shù)的增加，4種阿魏酸烷基酯的抗氧化能力相差越來越小。這與圖5中4種抗氧化劑在乳液界面區(qū)域的濃度差距越來越小相一致。這些結(jié)果說明，阿魏酸及其烷基酯在乳液中抗氧化能力的大小主要由其在乳液界面區(qū)域的分布決定。

2.4 阿魏酸及其烷基酯在乳液油相、水相和界面之間的分配常數(shù)

FA在均相溶液(甲醇)中的抗氧化效率最強(qiáng)，但是在乳液中FA-C8更有效。由于水包油乳液中脂類氧化通常發(fā)生在乳液液滴界面附近，因而FA及其烷基酯在乳液中的抗氧化效率不同的可能是由于乳液界面區(qū)內(nèi)的抗氧化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同引起的[1,10]。為找出FA-C8在乳液中最有效的原因，用假相動(dòng)力學(xué)模型法測定了FA及其烷基酯在乳液界面的分布。為此，首先測定了FA及其烷基酯在乳液油相、水相和界面之間的分配常數(shù)。

表2 FA及其烷基酯的分配常數(shù)值

圖4 偶氮染料(λ=572 nm)的吸光度和ln(At-Ainf)隨時(shí)間的變化

Figure 4 Changes in absorbance and ln(At-Ainf)of the azo dye with time

表3 FA及其烷基酯的表觀速率常數(shù)kobs隨乳化劑體積分?jǐn)?shù)ΦI的變化

2.5 阿魏酸及其烷基酯在乳液界面的分布

由圖6可知，F(xiàn)A及其烷基酯在界面區(qū)域的百分比隨乳化劑體積分?jǐn)?shù)ΦI的增加而增加，在ΦI為5.0%時(shí)超過90%的抗氧化劑位于界面區(qū)；在任何ΦI下，抗氧化劑在乳液界面區(qū)域的百分比大小順序?yàn)椋篎A-C8>FA-C4>FA-C2>FA-C12>FA。顯然，界面區(qū)抗氧化劑的百分比并不與抗氧化劑的疏水性直接相關(guān)。分析相同ΦI下界面區(qū)抗氧化劑百分?jǐn)?shù)隨烷基鏈長度的變化情況，可以看出隨著烷基鏈長度的增加，F(xiàn)A及其烷基酯的%AOI顯示出類似拋物線形狀，在C8達(dá)到最大值。這意味著，在相同乳化劑體積分?jǐn)?shù)下抗氧化劑在界面區(qū)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著FA烷基酯鏈長的增加先增加后下降。這些結(jié)果表明，乳液界面區(qū)中抗氧化劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)并不與抗氧化劑的疏水性直接相關(guān)；中等極性或中等鏈長的抗氧化劑在界面區(qū)的分?jǐn)?shù)達(dá)到最大。

表4 FA及其烷基酯的和kI值

圖5 FA在油水比為2∶8的菜籽油乳液中的kobs(K)和1/kobs(RK)隨ΦI的變化

Figure 5 Changes inkobs(K)and 1/kobs(RK)withΦIfor FA in 2∶8 rapeseed oil/water emulsions

從圖6中還可以看出，當(dāng)ФI從0.5%增加到5.0%時(shí)，F(xiàn)A及其烷基酯在界面區(qū)域的體積增加了10倍，但%AOI最多只增加了約45%，這意味著FA及其烷基酯在界面的摩爾濃度約降至原來的1/7。AO反應(yīng)性和效率均取決于其界面摩爾濃度，濃度降低會(huì)導(dǎo)致AO效率降低。這是FA及其烷基酯的抗氧化效率隨吐溫20體積分?jǐn)?shù)增加而下降的原因。這一結(jié)果表明，對FA及其烷基酯抗氧化效率起決定性的因素是其在乳液界面區(qū)域的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，與其他研究人員研究沒食子酸[1]、綠原酸、迷迭香酸[8]和咖啡酸[10]及其烷基酯所得的結(jié)果相似，烷基鏈在中等鏈長(C4～C12)的抗氧化活性最高，隨后AO活性下降，體現(xiàn)出“截止效應(yīng)”。

圖6 FA及其烷基酯在乳液界面區(qū)域的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨乳化劑體積分?jǐn)?shù)ФI的變化

Figure 6 Changes in the percentages of FA and its alkyl esters in the emulsion interfacial region with different volume fractions of emulsifier

3 結(jié)論

試驗(yàn)研究了FA及其烷基酯在均相甲醇溶液和在水包菜籽油乳液中的抗氧化效率。結(jié)果表明，F(xiàn)A在均相甲醇溶液中的抗氧化效率最強(qiáng)，而在菜籽油乳液中FA-C8的抗氧化效率最強(qiáng)。假相動(dòng)力學(xué)模型結(jié)果表明，F(xiàn)A及其烷基酯的抗氧化效率與其在乳液界面區(qū)域的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對應(yīng)。在其他條件都相同的情況下，F(xiàn)A-C8在乳液界面區(qū)中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大。試驗(yàn)結(jié)果說明，抗氧化劑在乳液中的抗氧化效率主要與其在乳液界面的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有關(guān)；在其他條件都相同的情況下，阿魏酸及其烷基酯在乳液中最有效的是在界面區(qū)中百分比最大的。