堿預處理對固體碳源生物可利用性及其強化生物脫氮效能的影響?

馬雨陽， 紀鴻飛， 孫昭玥， 鄭西來,3??， 辛 佳,3

(1.中國海洋大學環(huán)境科學與工程學院，山東 青島 266100； 2.中國科學院南京土壤研究所，江蘇 南京 210008； 3. 中國海洋大學海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室，山東 青島266100)

地下水硝酸鹽污染問題日益嚴重，除了農業(yè)施肥、污水灌溉等導致的面源污染外，化糞池、生活垃圾堆放處、農家肥儲存地等集中點源也是地下水硝酸鹽污染的重要來源[1-2]。在包氣帶構建脫氮層是阻控硝酸鹽向地下水運移的一種有效措施，包氣帶能夠為其中廣泛存在的反硝化細菌創(chuàng)造天然的厭氧環(huán)境，因此高效低耗的反硝化生物脫氮有很大的應用潛力。然而生物可利用的碳源不足，會制約反硝化脫氮效率[3]。國內外學者多采用添加木質纖維素類物質如木屑、稻草等固體碳源的方法來提高反硝化脫氮效果[4-5]，這些物質來源廣泛而且價格低廉。但是在實際應用中，直接以纖維素類物質作為外加碳源時，由于其具有結構復雜、性質穩(wěn)定等頑抗特性，后期生物可利用性降低，導致脫氮效果較差[6]。例如，Schipper等[7]在表層土以下安裝添加花木碎屑的脫氮層來處理乳制品廠的廢水，由于硝酸鹽停留時間較短，后期碳源可利用性下降，無法顯著減少硝酸鹽的下滲。針對這一問題，可考慮對纖維素類物質進行預處理來解決。此前，各種木質生物質預處理技術多應用于生物燃料領域[8]，僅有少量研究關注預處理后生物質作為固體碳源的促反硝化效果。馬玉霞等[5]研究發(fā)現(xiàn)，用Ca(OH)2對水稻、小麥、玉米和高粱4 種典型農作物的秸稈進行預處理，經過處理的秸稈酶解產糖量較高，作為固體碳源的反硝化速率大大提高。此外，之前的研究多依托批量試驗體系開展，不能真實反映實際脫氮層在運行過程中的作用效能。

本研究采用易于獲取、價格低廉的弱堿Ca(OH)2對玉米芯和麥秸進行預處理，以酶解還原糖產量來表征固體碳源的生物可利用性[9]，考察Ca(OH)2投加量、處理溫度和處理時間對碳源酶解產糖量的影響，優(yōu)化堿處理條件。依托優(yōu)選出的外加碳源，在室內模擬構建強化脫氮層，通過對出水pH、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮含量等進行監(jiān)測，考察脫氮層中添加的碳源種類、粒徑及膨潤土含量對脫氮效能的影響，為構建穩(wěn)定且高效的脫氮層提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米芯和麥秸均收集于山東省萊西市。試驗用土樣取自山東省萊西市店埠鎮(zhèn)大田，取樣深度在地表以下20～50 cm，土壤成土母質為沖積和沖洪積層，屬于砂質壤土，自然風干到田間持水量的45%，然后過2 mm篩備用。石英砂過篩保留0.5～1 mm粒級部分，洗凈，烘干備用。膨潤土為人工改性的鈉基膨潤土，在蒸餾水中的膨脹比為20，購買自河南省鞏義市夾津口龍躍濾材經銷部。

1.2 方法

1.2.1 碳源材料的預處理 將玉米芯和麥秸水洗、60 ℃烘干，粉碎后過篩，取用0.18～0.7 mm(24～80目)粒徑部分的原料，再次水洗、烘干，作為預處理的原材料備用。往150 mL的具塞錐形瓶中分別加入5 g的玉米芯和麥秸，然后分別加入50 mL(玉米芯)和75 mL(麥秸)的蒸餾水，最后加入一定量的Ca(OH)2。將具塞錐形瓶置于搖床中油浴，控制轉速為150 r/min，并設置一定的溫度和反應時間，然后對處理后的碳材料進行抽濾，用水沖洗至濾液的pH值為7.0～7.5，60 ℃下烘干，最后測定處理后的碳材料質量并密封保存?zhèn)溆?。每種處理均進行三組平行試驗。具體試驗條件設置如表1所示。

表1 堿處理試驗設計Table 1 Design of alkali treatment experiment

1.2.2 酶解產糖量的測定 以酶解產糖量來表征預處理前后固體碳源的生物可利用性。稱取碳材料(24～80目)1.0 g于50 mL的離心管中，分別加入10 FPU/g干物質纖維素酶和20 CBU/g干物質的β-葡萄糖苷酶，用醋酸鈉緩沖溶液調節(jié)反應體系的pH值為4.8，然后加入0.03%的疊氮化鈉。將離心管置于恒溫搖床中，設定轉速和溫度分別為100 r/min和50℃，培養(yǎng)3天后離心，取出上清液過濾，最后用DNS(3,5-二硝基水楊酸)法測定濾液中還原糖含量。纖維素酶和β-葡萄糖苷酶均購于江蘇銳陽生物科技有限公司，纖維素酶酶活為48.6 FPU/g，β-糖苷酶酶活為826.0 CBU/g。

1.2.3 碳源材料生物質組分的測定 碳材料(24～80目)的木質素、半纖維素、纖維素、丙酮抽提物以及灰分含量根據Lin等[10]和Ayeni等[11]的方法進行測定。

1.2.4 脫氮反應層的構建 強化脫氮反應層的實驗模擬裝置主要包括供水裝置、滲濾土柱和集水容器。供水裝置由儲水箱、潛水泵、供水箱和流量調節(jié)閥組成，進行定流量供水。滲濾反應器為直徑10 cm高50 cm的PVC柱，PVC柱下部設有出水口，試驗裝置如圖1所示。

(1-儲水箱，2-潛水泵，3-供水箱，4-流量調節(jié)閥，5-布水層， 6-脫氮層，7-集水層，8-集水容器。1-Water tank,2-Submerged pump,3-Feed tank,4-Flow control valve, 5-Distribution water layer,6-Denitrification layer,7-Catchment layer,8-Catchmentvessel.)

圖1 試驗裝置示意圖
Fig.1 Schematic diagram of experimental set-up

脫氮層土柱由下至上依次裝填，最下層是集水層，由5 cm厚的石英砂組成(粒徑為0.5～1.0 mm，容重為1.55 g/cm3)；中間層是20 cm厚的脫氮層(1.01 g/cm3等容重填充)；最上層為布水層，填充材料及厚度與最下層集水層相同。用200目的不銹鋼篩網將反應層與布水層和集水層分隔。通過調整脫氮層的填充介質配比，共構建4組不同的生物脫氮反應層，研究碳源種類、粒徑及膨潤土含量對脫氮層效果的影響。脫氮層填充的材料及組成如表2所示，其中2 mm和0.5～1.5 mm玉米芯的預處理方式同1.2.1。將各種介質按比例稱量、均勻混合后，以等容重1.01 g/cm3裝入PVC柱中。

表2 脫氮層的構成Table 2 The composition of denitrification layer

2 結果與討論

2.1 預處理工藝優(yōu)化

2.1.1 溫度對碳源生物可利用性的影響 添加0.1 g Ca(OH)2/g干物質，反應時間為24 h，考察溫度對碳材料的酶解還原糖產量的影響，結果如圖2所示。結果表明，未進行預處理的玉米芯和麥秸的酶解還原糖產量分別為191.3和86.4 mg/g干物質，經過不同溫度的堿處理之后，玉米芯和麥秸的酶解產糖量相比原材料提高了1.6～2.1倍和3.1～3.5倍。由圖2可以看出，隨著溫度的升高，玉米芯的還原糖產量呈現(xiàn)先逐漸上升然后略有下降的趨勢。而麥秸的酶解產糖量隨溫度的升高變化不明顯。在70 ℃的處理溫度下，玉米芯的還原糖產量最高，可達到593 mg/g干物質，麥秸還原糖產量最高是在95 ℃，可達389 mg/g干物質。因此，玉米芯和麥秸Ca(OH)2預處理的最佳溫度分別為70和95 ℃。

圖2 處理溫度對固體碳源還原糖產量的影響Fig.2 Influence of treatment temperature on reducing sugar yield of solid carbon source

2.1.2 預處理時間對碳源生物可利用性的影響 預處理時間也是影響碳材料生物可利用性的重要因素之一，添加0.1g Ca(OH)2/g干物質，控制反應溫度95 ℃，分析不同處理時間對碳材料可生化性的影響，碳材料酶解還原糖產量隨處理時間的變化如圖3所示。分析結果發(fā)現(xiàn)，堿處理時間的改變對玉米芯和麥秸酶解性能的影響不大。延長處理時間，玉米芯和麥秸的還原糖產量先略有上升然后逐漸下降至稍低的水平。這是由于堿不僅會使碳材料中的木質素結構被破壞，同時也會釋放出部分易溶解的半纖維素。因此，堿處理時間過長易導致碳材料中溶解性有機碳的釋放，不僅不能提高碳源的酶解性能，反而會使碳材料中可利用碳的數量減少。由圖3可知，玉米芯和麥秸的最優(yōu)預處理時間分別為6和24 h，酶解還原糖達到最大值分別為611和389 mg/g干物質，比原材料提高了2.2和3.5倍。

圖3 處理時間對固體碳源還原糖產量的影響Fig.3 Influence of treatment time on reducing sugar yield of solid carbon source

2.1.3 Ca(OH)2添加量對碳源生物可利用性的影響 通過以上研究可以知道，玉米芯碳源在處理溫度為70 ℃，處理時間為6 h時酶解產糖量達到最大，而麥秸在95 ℃和24 h處理條件下還原糖產量才達到最大。因此，控制玉米芯和麥秸預處理條件分別為70 ℃、6 h和95 ℃、24 h，研究Ca(OH)2添加量對碳材料酶解產糖量的影響，結果如圖4所示。研究發(fā)現(xiàn)，隨著Ca(OH)2投加量的增加，玉米芯和麥秸的酶解產糖量逐漸增加然后趨于穩(wěn)定。Ca(OH)2投加量為0.1 g/g干物質時，玉米芯和麥秸的酶解產糖量分別達到最大值657.1和370.15 mg C6H12O6/g干物質。繼續(xù)增大Ca(OH)2投加量，碳材料的還原糖產量沒有明顯提高。

綜合以上三組結果可以知道，碳源預處理的最佳條件為：添加0.1 g Ca(OH)2/g干物質、在70 ℃下處理玉米芯6 h；添加0.1 g Ca(OH)2/g干物質、在95 ℃下處理麥秸24 h。在最優(yōu)條件下處理的玉米芯和麥秸，酶解產糖量分別提高了2.4和3.3倍。無論堿處理前或后，

玉米芯相比麥秸都具有更高的生物可利用性。因此選擇玉米芯作為強化脫氮層的外加碳源。

圖4 Ca(OH)2投加量對碳源還原糖產量的影響Fig.4 Influence of dosage of Ca(OH)2 on reducing sugar yield of solid carbon source

2.1.4 碳材料堿解質量損失與其生物可利用性的相關分析 在上述最優(yōu)條件下對碳源材料進行預處理，分析其處理前后的物質組成，結合組分變化來分析堿解質量損失與碳源生物可利用性之間的關系。對不同堿處理條件下玉米芯和麥秸的質量損失和酶解還原糖產量進行線性相關分析，結果如圖5所示。石灰處理后玉米芯的堿解質量損失和還原糖產量呈顯著相關(R2=0.83，P<0.001)，麥秸也存在相似的正相關關系(R2=0.59，P<0.001)。玉米芯和麥秸碳源材料的物質組成如表3所示。

表3 碳源材料的化學組成Table 3 The chemical composition of carbon source /%

(a、b分別表示玉米芯和麥秸。a, b represent corncob and wheat straw respectively.)

玉米芯和麥秸的堿解質量損失和還原糖產量間的正線性相關關系主要與堿處理后碳材料的可及表面積、木質素半纖維素含量等的變化有關。目前文獻報道的堿預處理方法都能在一定程度上提高木質纖維素的可及表面積[6]。同時，本研究中堿處理以后碳源材料的質量有一定程度的下降，也間接表明了預處理通過在材料中產生多孔結構導致可及表面積的增加，從而有利于酶解[12]。經過預處理以后，玉米芯和麥秸都有堿解質量損失，其中的木質素含量分別降低了1.44%和1.31%，半纖維素含量則分別降低了9.3%和17.37%，纖維素含量顯著增加(見表3)。由此可得，堿處理會溶解部分木質素和半纖維素，半纖維素的水解會導致木質纖維素結構發(fā)生變化，增加酶對纖維素和半纖維素的可及性，進而提高酶解還原糖的產量[13]，也有研究直觀證明了半纖維素含量的減少有利于底物對纖維素酶的吸附[14]，因此酶解還原糖產量也和木質素半纖維素含量變化有關。

2.2 脫氮反應層的運行效能

2.2.1 滲透速率的動態(tài)變化 研究表明，在人工濕地、地下水滲透反應墻和相關的土地處理系統(tǒng)中，影響反應介質使用壽命的關鍵因素之一就是堵塞[15]。堵塞是所有高負荷污水過濾系統(tǒng)中常見的自然效應，適度的介質堵塞可以增大脫氮層處理系統(tǒng)內部的非飽和流動區(qū)域，提高系統(tǒng)的處理效果；而過度的堵塞會使脫氮層的水力性能變差，污水不能得到有效處理，最終影響到處理系統(tǒng)的處理效率和使用壽命[16]。通過對脫氮層滲透出水速率的連續(xù)監(jiān)測，考察整個反應期內各脫氮層滲透性能的變化，這對優(yōu)化脫氮層的設計，提高脫氮層使用壽命具有重要意義。

不同脫氮層土柱的滲濾出水速率隨時間的變化曲線如圖6所示?？梢钥闯?，反應運行的初始進水流量為(50±5) mm/d，脫氮層運行的第一周內，A、B、C脫氮層的滲透速率緩慢下降至(35±5) mm/d，而D層的滲透速率不規(guī)律地降低至28 mm/d。在第9天用真空泵從每個脫氮層的出水口進行排氣，排除反硝化產生的氣體。在排氣之后，出水速率明顯提高至初始進水的水平，隨后又呈現(xiàn)緩慢下降趨勢，然后出水速率趨于穩(wěn)定至結束。D脫氮層在整個運行周期內滲透出水速率都低于A、B、C層，至脫氮層運行結束時，A、B、C、D層滲透速率分別下降至19、10、17和8 mm/d。分析可以得出，添加了膨潤土的D脫氮層與未添加的相比出水速率更低，較容易出現(xiàn)堵塞問題。C層相比B層采用較大粒徑填料能夠在一定程度上提高出水速率，降低了堵塞發(fā)生的概率。在第9天對脫氮層土柱進行排氣處理，破壞了反硝化產生的氣阻，使排氣之后的出水速度增加，這說明造成脫氮層滲透性下降的原因除了已有研究指出的微生物堵塞[15]以外，氣體堵塞也是導致脫氮層滲透性能下降的原因之一。在脫氮層運行后期，D層發(fā)生積水并在出水口處出現(xiàn)斷斷續(xù)續(xù)的成股水流，其他層未出現(xiàn)。當脫氮層滲透性下降至一定程度會造成填料表面產生積水，誘發(fā)短流或繞流[16]，水體有效停留時間縮短，使微生物無法充分降解污水中的污染物[17]。排氣處理可以較大程度的恢復脫氮層的滲透性，因此，調節(jié)脫氮反應層的滲透性能，對于保證反硝化效果，延長脫氮層使用壽命十分必要。

2.2.2 出水pH的變化 pH值是影響生物生長繁殖的主要環(huán)境因素之一，對于反硝化微生物而言，適宜的pH值為5.5～8.0[18]。在脫氮反應層運行過程中，進出水的pH隨時間的變化如圖7所示。在整個脫氮層運行過程中，pH雖然有升降，但一直保持在適宜反硝化微生物活動的范圍內，這為反硝化的進行提供了有利的環(huán)境條件。在反應的前7天，進水的pH較為穩(wěn)定，而A、B、C脫氮層系統(tǒng)出水pH逐漸降低，這可能因為纖維素在微生物作用下分解，產生乳酸和乙酸等小分子的有機酸[19]，從而使出水pH不斷下降。當少量纖維素被分解時，細菌自身在不斷消耗有機酸等分解產物，而反硝化過程中產生的堿性物質也逐漸中和纖維素分解所產生的酸度[19]，使pH升高，因此脫氮層A、B、C、D運行大約一周以后，出水的pH值由原來的下降變?yōu)榫徛仙筅呌诜€(wěn)定。綜上，脫氮層內部的各種反應對pH 值起到了一定的調節(jié)作用，使脫氮層的pH較為穩(wěn)定。

圖6 脫氮層滲透速率隨時間的變化曲線Fig.6 Change of seepage velocity of denitrification layer according to time

圖7 脫氮層出水pH隨時間的變化曲線Fig.7 Change of pH of denitrification layer percolate according to time

2.2.3 脫氮層對硝酸鹽的去除效果 考察不同脫氮層對硝態(tài)氮去除效果的影響，結果如圖8所示，可以看出，在反應層運行初期，添加堿處理玉米芯的脫氮層(B、C、D層)在第2天對硝酸鹽的去除率就達到60%左右，而脫氮層A達到相同的去除效果需要10天以上。由此可以得出，添加堿處理玉米芯的脫氮層啟動速度快，這與碳源的可利用性高有著密切的關系[20]。在脫氮層的整個運行階段，與添加玉米芯原材料的脫氮層相比，以堿處理玉米芯作為碳源的脫氮層有更高的硝酸鹽去除率，去除率可達到80%～97%，而玉米芯原料脫氮層只能去除60%左右的硝態(tài)氮。因此，堿石灰處理生物質材料用作碳源，可有效提高脫氮層的硝酸鹽去除率。

(a、b、c和d分別表示脫氮層A、B、C和D。a, b, c and d represent denitrification layer A, B, C and D respectively.)

圖9 脫氮層滲濾液中亞硝態(tài)氮濃度變化Fig.9 Change of concentration of nitrite nitrogen of denitrification layer percolate

3 結論

(2)無論堿處理前后，玉米芯相比麥秸都具有更高的生物可利用性，因此選用玉米芯作為外加碳源構建強化脫氮層。玉米芯構建的脫氮層具有穩(wěn)定pH值的能力，使其一直保持在反硝化適宜的范圍內。

(3)未處理玉米芯構建的脫氮層只能去除60%～67%的硝態(tài)氮，而小粒徑堿處理玉米芯(24～50目)構建的脫氮層效能最好，硝酸鹽去除率穩(wěn)定在90%以上，且啟動后不會出現(xiàn)亞硝酸鹽積累現(xiàn)象。適當添加膨潤土能夠通過降低滲透性來延長硝酸鹽在脫氮層中的停留時間，提高脫氮層處理效果。