病毒性心肌炎患兒血清miR-133及miR-155水平的表達(dá)及臨床意義

鄧國(guó)清，魯利群，楊欣，賀靜，王旭，黃莉

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是由親心肌細(xì)胞病毒感染引起的心肌細(xì)胞炎性反應(yīng)，常見(jiàn)病毒包括柯薩奇B組病毒、巨細(xì)胞病毒及腸病毒等的感染均可導(dǎo)致VMC[1]。VMC患兒臨床表現(xiàn)不一，嚴(yán)重時(shí)可引起心力衰竭、心源性休克等并發(fā)癥，危及患兒生命[2]。微小RNA(micro RNAs，miRNA)是一類小的內(nèi)源性非編碼RNA，長(zhǎng)度18～25個(gè)核苷酸，miRNA可以通過(guò)與信使RNA(mRNAs)結(jié)合以阻止蛋白質(zhì)翻譯，并在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后下調(diào)基因表達(dá)，其在多種生物過(guò)程中發(fā)揮重要作用，如細(xì)胞增殖分化、炎性反應(yīng)、腫瘤、免疫等病理生理過(guò)程的調(diào)控[3]。近年來(lái)有研究表明，某些miRNA的異常表達(dá)，如miR-133、miR-155等，與心肌炎、動(dòng)脈粥樣硬化等多種心血管疾病有關(guān)[4]，檢測(cè)患者循環(huán)血中miRNA表達(dá)水平有助于對(duì)疾病嚴(yán)重程度的判斷以及治療方式的選擇[5-6]。miR-133定位于人類第6號(hào)染色體上，是一個(gè)多功能miRNA；miR-155定位于人染色體21q21，其由B細(xì)胞整合族第3個(gè)外顯因子的高度保守區(qū)域編碼而成。本研究通過(guò)檢測(cè)VMC患兒血清中miR-133、miR-155的表達(dá)水平，并分析兩者與VMC患兒心肌損傷、炎性因子及免疫功能等指標(biāo)的相關(guān)性，以初步探討其臨床意義，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年2月—2018年6月成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科收治的急性期VMC患兒97例作為病例組，根據(jù)左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)和肌鈣蛋白Ⅰ(cardiac troponinⅠ,cTnI)結(jié)果，將病例組分為輕度VMC亞組和重度VMC亞組，其中輕度VMC亞組(LVEF≥50%，cTnI≤0.1 ng/ml)56例，男31例，女 25例；年齡1～12(6.25±1.18)歲；病程2～15(8.21±5.10)d；誘因：上呼吸道感染32例，腸道感染14例，原因不明10例；臨床癥狀：乏力27例，心悸16例，多汗13例；合并心力衰竭2例，合并嚴(yán)重心律失常1例。重度VMC亞組(LVEF<50%，cTnI>0.1 ng/ml)41例，男25例，女16例；年齡11個(gè)月～11歲(6.11±1.26)歲；病程2～17(9.13±4.80)d；誘因：上呼吸道感染23例，腸道感染11例，原因不明7例；臨床癥狀：乏力21例，心悸11例，多汗9例；合并心力衰竭2例，合并嚴(yán)重心律失常4例。另選取同期于醫(yī)院進(jìn)行健康體檢的健康兒童40例作為健康對(duì)照組，其中男24例，女16例，年齡11個(gè)月～12歲。3組兒童的性別、年齡等比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)通過(guò)，全部患兒家屬知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患兒均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的VMC診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，包括存在心功能不全、心源性休克，影像學(xué)存在心臟擴(kuò)大、異常的心電圖改變，肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)或cTnI升高，病原學(xué)檢查呈陽(yáng)性；②患兒年齡≤12歲。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①由先天性心臟病、風(fēng)濕性心肌炎及代謝性疾病導(dǎo)致的心肌損害患兒；②合并肝腎等系統(tǒng)疾病患兒；③既往有VMC病史或家族史的患兒。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法 分別于VMC患兒入院次日以及健康對(duì)照組兒童健康體檢時(shí)抽取受試兒童晨起空腹靜脈血5 ml待測(cè)。

1.3.1 免疫指標(biāo)檢測(cè)：上述血樣2 ml置于EDTA抗凝管中，采用流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)檢測(cè)血漿CD4+、CD8+水平，并計(jì)算CD4+/CD8+值。

1.3.2 心肌損傷與炎性因子指標(biāo)檢測(cè)：上述血樣3 ml室溫下靜置0.5 h后，離心取上清液，部分置于-20℃冰箱保存待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附法(試劑盒購(gòu)自北京北方免疫試劑研究所)檢測(cè)血清CK-MB、白介素-10(IL-10)、白介素-17(IL-17)、白介素-21(IL-21)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteine aspartate proteolytic enzyme，Caspase-3)、可溶性凋亡相關(guān)因子配體(soluble apoptosis-related factor ligand，sFasL)水平，采用電化學(xué)發(fā)光法(試劑盒購(gòu)自美國(guó)Spectral Diagnostics公司)檢測(cè)血清cTnI水平，以上操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.3 血清miR-133與miR-155表達(dá)水平檢測(cè)：余部分血清置于EP管中，保存于-80℃冰箱，應(yīng)用miRNeasy Serum試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司)提取血清中總RNA，采用紫外分光光度計(jì)鑒定RNA提純液純度后，將樣本保存于-80℃冰箱。應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司)在熒光定量PCR儀器(ABI 7000)上進(jìn)行PCR反應(yīng)。miR-133特異性正向引物序列：5'-TTGGTCCCCTTCAACCAGCTGT-3'，miR-155正向引物序列：5'-TTAATGCTAATCGTGATAGGGGT-3'，內(nèi)參基因U6上游序列：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，通用的下游引物：5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'。反應(yīng)體系： SYBR Green Mix 10 μl， cDNA模板2 μl，無(wú)RNA酶水4 μl，引物2 μl。反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本重復(fù)3次。應(yīng)用相對(duì)定量法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，以2-ΔΔCt法計(jì)算血清miR-133與miR-155的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 免疫功能、心肌損傷、炎性因子指標(biāo)比較 與健康對(duì)照組比較，重度VMC亞組患兒CD8+、CK-MB、cTnI、sFasL、Caspase-3、IL-17、IL-21水平明顯升高，而血漿CD4+、CD4+/CD8+、IL-10明顯降低(P<0.05)，輕度VMC亞組患兒CD8+、CK-MB、 sFasL、Caspase-3、 IL-17、IL-21水平明顯升高，而IL-10水平明顯降低(P<0.05)；與輕度VMC亞組患兒比較，重度VMC亞組患兒CK-MB、cTnI、sFasL水平明顯升高，而CD4+水平明顯降低(P<0.05)；余指標(biāo)3組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 血清miR-133和miR-155表達(dá)水平比較 與健康對(duì)照組比較，重度VMC亞組、輕度VMC亞組血清miR-133表達(dá)水平明顯降低，miR-155表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與輕度VMC亞組患兒比較，重度VMC亞組患兒血清miR-133表達(dá)水平明顯降低，miR-155表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組血清miR-133和miR-155表達(dá)水平比較

2.3 血清miR-133、miR-155的表達(dá)與各指標(biāo)的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，VMC患兒血清miR-133的表達(dá)與CD4+/CD8+呈正相關(guān)，與CK-MB、cTnI呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與CD4+、CD8+、sFasL、Caspase-3、IL-10、IL-17、IL-21無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)；miR-155的表達(dá)與CD4+/CD8+呈負(fù)相關(guān)，與CK-MB、cTnI呈正相關(guān)(P<0.05)，與CD4+、CD8+、sFasL、Caspase-3、IL-10、IL-17、IL-21無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表1 各組心肌損傷、炎性因子及免疫功能指標(biāo)比較

表3 VMC患兒血清miR-133、miR-155的表達(dá)

3 討 論

血清中生物標(biāo)志物的檢測(cè)是診斷心血管疾病的重要手段。近年來(lái)研究表明，miRNA參與了心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展，循環(huán)中的miRNA具有靈敏度高、穩(wěn)定、序列保守等優(yōu)點(diǎn)，是一種可應(yīng)用于心血管疾病診斷和預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物[8]。VMC患兒血清中存在多種miRNA異常表達(dá)的現(xiàn)象，如在心力衰竭患者中，miR-133可以抑制ERG基因中 mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)，調(diào)節(jié)ERG編碼的鉀離子通道的表達(dá)，抑制病理性QT間期延長(zhǎng)，從而可以抑制心肌的電生理重塑，進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)性作用[9-10]。有研究表明，VMC患兒血清miR-133表達(dá)調(diào)控功能失常，患兒易發(fā)生惡性心律失常及心功能下降[11]。miR-155在多種心血管疾病中均存在異常表達(dá)的現(xiàn)象，如在急性心肌梗死動(dòng)物模型中，活化巨噬細(xì)胞的外泌體中miR-155的表達(dá)增加，富含miR-155的外泌體可以抑制成纖維細(xì)胞增殖并促進(jìn)成纖維細(xì)胞炎性反應(yīng)，而敲除miR-155可以明顯降低急性心肌梗死后心臟破裂的發(fā)生率[12]。此外，在VMC大鼠中，血清miR-155表達(dá)上調(diào)，而在敲除miR-155后，心肌細(xì)胞的損傷及炎性反應(yīng)減輕，心臟功能失調(diào)也明顯減輕[13]。上述研究表明miR-133、miR-155的表達(dá)可能與VMC的發(fā)生、發(fā)展存在一定關(guān)聯(lián)。

本結(jié)果顯示， VMC患兒與健康對(duì)照組間CD4+、CD8+、CD4+/ CD8+、CK-MB、cTnI、sFasL、Caspase-3、IL-10、IL-17、IL-21水平有明顯差異，表明機(jī)體的免疫功能、心肌損傷、炎性因子的異常與VMC的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。當(dāng)發(fā)生VMC時(shí)，患兒體內(nèi)的單核巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫及IL-10、IL-17、IL-21等細(xì)胞因子可以形成復(fù)雜的炎性反應(yīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其參與了VMC過(guò)程中炎性反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展[14]。另外，患兒一旦發(fā)生VMC，病毒感染將促使單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞釋放大量細(xì)胞因子，從而可以促進(jìn)心肌細(xì)胞表面CD54表達(dá)，進(jìn)而造成淋巴細(xì)胞黏附及氧自由基介導(dǎo)的損傷。

本研究中，VMC患兒血清miR-155表達(dá)水平明顯高于健康對(duì)照組，且重度VMC患兒血清miR-155表達(dá)水平明顯高于輕度VMC患兒，結(jié)果表明VMC患兒血清miR-155表達(dá)水平上調(diào)，其表達(dá)水平上調(diào)程度與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)。目前VMC患兒血清miR-155水平上調(diào)機(jī)制尚不清楚，可能與炎性反應(yīng)微環(huán)境中某些物質(zhì)通過(guò)激活促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生有關(guān)。miR-155表達(dá)上調(diào)后可影響免疫細(xì)胞的功能，其可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化，從而可以發(fā)揮抑制免疫的功能。有研究表明，VMC期間的心臟損傷不是由病毒對(duì)心肌細(xì)胞的直接細(xì)胞毒作用引起，而是通過(guò)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行損傷[15-16]。本研究中進(jìn)一步分析了VMC患兒血清miR-155與各指標(biāo)間的相關(guān)性，結(jié)果顯示，VMC患兒血清miR-155的表達(dá)與CD4+/CD8+呈負(fù)相關(guān)。miR-155可能通過(guò)抑制免疫細(xì)胞如Treg、Th17細(xì)胞的活化，影響IL-4、IL-10等細(xì)胞因子的分泌，從而發(fā)揮免疫抑制的作用。另外，miR-155的表達(dá)與CK-MB、cTnI呈正相關(guān)，表明miR-155的表達(dá)與患者心功能損傷的嚴(yán)重程度有關(guān)，其有可能成為評(píng)價(jià)心肌損傷嚴(yán)重程度的指標(biāo)。國(guó)內(nèi)學(xué)者亦報(bào)道VMC患兒外周血中高表達(dá)miR-155能夠造成心肌細(xì)胞損傷及凋亡[17]。

miR-133特異性表達(dá)于心肌與骨骼肌中，包括miR-133a和miR-133b等2種類型，其參與了調(diào)控心肌細(xì)胞的分化、增生、肥大及凋亡，并能影響心肌細(xì)胞鈣離子通道的功能，維持正常心肌細(xì)胞動(dòng)作電位復(fù)極化[18]。本研究中，VMC組患兒血清miR-133表達(dá)水平明顯低于健康對(duì)照組兒童，且重度VMC亞組患兒血清miR-133表達(dá)水平明顯低于輕度VMC亞組，表明VMC患兒血清miR-133表達(dá)水平下降，且其表達(dá)水平下降程度與疾病的病情嚴(yán)重程度有關(guān)。分析其可能原因?yàn)楫?dāng)患兒發(fā)生VMC時(shí)，肌細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子，如肌細(xì)胞增強(qiáng)因子-2、肌原性分化因子-1等減少，從而導(dǎo)致以上因子調(diào)控miR-133的轉(zhuǎn)錄作用下降，進(jìn)而使得miR-133表達(dá)水平下降[19]。另外，當(dāng)患兒發(fā)生VMC時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子CASP9的表達(dá)下降，也可導(dǎo)致miR-133的表達(dá)下降[20]。有研究表明，正常心肌細(xì)胞中miR-133能抑制血清反應(yīng)因子(serum response factor，SRF)的激活，而VMC患兒心肌細(xì)胞中miR-133表達(dá)下調(diào)，結(jié)合在啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)的SRF被激活，從而促進(jìn)了心肌細(xì)胞特異性生長(zhǎng)和分化因子的表達(dá)，進(jìn)而促使心肌細(xì)胞肥大，結(jié)構(gòu)重塑[21]。此外，miR-133水平降低后，其喪失了對(duì)肌成纖維細(xì)胞的Cyclin D1的抑制作用，肌成纖維細(xì)胞將過(guò)度增殖，從而促進(jìn)間質(zhì)纖維化形成[21]。本研究中，VMC患兒血清miR-133的表達(dá)與CD4+/CD8+呈正相關(guān)，與心肌損傷指標(biāo)CK-MB、cTnI呈負(fù)相關(guān)，表明miR-133同樣參與了VMC中炎性反應(yīng)免疫調(diào)控，影響心肌細(xì)胞損傷的過(guò)程[22]。

綜上所述，VMC患兒血清miR-133表達(dá)水平降低，而miR-155表達(dá)水平升高，兩者均與部分心肌損傷及免疫功能指標(biāo)存在相關(guān)性，其參與了VMC發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程，檢測(cè)VMC患兒血清miR-133和miR-155表達(dá)水平可能有助于疾病診斷、病情嚴(yán)重程度判斷。

利益沖突：無(wú)

作者貢獻(xiàn)聲明

鄧國(guó)清：提出研究方向、研究思路、研究選題；魯利群：設(shè)計(jì)研究方案、研究流程；楊欣：實(shí)施研究過(guò)程，數(shù)據(jù)收集，分析整理；賀靜：進(jìn)行文獻(xiàn)調(diào)研與整理；王旭：設(shè)計(jì)論文框架，撰寫(xiě)論文；黃莉：起草論文、修訂論文、論文終審