高效液相熒光法測定養(yǎng)殖水產(chǎn)中四種氟喹諾酮類藥物殘留

馮 濤， 鄔玲玲

(杭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310018)

引 言

氟喹諾酮(Fluoroquinolones,FQs)是一種人工合成的抗菌類藥物，具有抗菌作用強、抗菌性廣等特點，目前被養(yǎng)殖戶廣泛應(yīng)用。我國于20世紀70年代開始將環(huán)丙沙星、恩諾沙星、達氟沙星、沙拉沙星等喹諾酮類藥物應(yīng)用于水產(chǎn)病害防治。隨著FQs的廣泛應(yīng)用，在水產(chǎn)品體內(nèi)藥物殘留情況越來越嚴重，也將對人類造成極大的危害。因此，人們對FQs的藥物殘留檢測研究越來越重視。世界各國已將氟喹諾酮列為動物性食品中殘留檢測的重點監(jiān)控藥物，對水產(chǎn)品體內(nèi)的氟喹諾酮殘留有嚴格的標準和要求[1-3]。

目前測定氟喹諾酮藥物殘留方法包括毛細管電泳法、薄層色譜法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法等。本研究采用固相萃取技術(shù)進行水產(chǎn)品富集等前處理，用熒光檢測器的液相色譜儀梯度洗脫檢測，測定人工養(yǎng)殖水產(chǎn)品中氟喹諾酮殘留[4-5]。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters e2695高效液相色譜儀，美國Waters公司；Waters2475熒光檢測器，美國Waters公司；明澈-D型超純水器，美國Millipore公司；YGC-6A固相萃取儀，鄭州寶晶電子科技有限公司；KQ3200E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；HLB固相萃取柱，6 cc/500 mg，美國waters公司；HSC-24B氮吹儀，恒奧科技有限公司；離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；渦旋振蕩器，ABSON Vortex Mixer。

甲醇、乙腈，色譜級，美國TEDIA公司；氟喹諾酮類標準品：環(huán)丙沙星、恩諾沙星、達氟沙星、沙拉沙星，美國CATO公司。

1.2 樣品前處理

稱取5.00(±0.01)g對蝦肉、大閘蟹肉、黑魚肉置于50 mL離心管中，加入甲酸(1%甲酸)-乙腈溶液10 mL，渦旋振蕩1 min，超聲提取20 min后，4 000 r/min離心10 min，取上清液于另一干凈離心管中。殘留組織重復(fù)操作提取，合并上清液。將HLB固相萃取柱用3 mL甲醇、3 mL水活化，取10 mL提取液上清樣后，用3 mL甲醇洗脫，氮吹至凈干，用乙腈定容至1 mL，用0.22 μm濾膜過濾，取0.5 mL加入1 mL 20×10-9的混合標準液。

1.3 HPLC分析

采用C18(5 μm，4.6×250 nm)色譜柱，流速：0.6 mL/min，柱溫為35 ℃，進樣量為10 μL，熒光檢測器檢測波長：激發(fā)波長280 nm，發(fā)射波長450 nm，以乙腈和0.02%的甲酸水溶液(pH=3.0)作為流動相進行梯度洗脫，洗脫方法見第34頁表1。

表1 流動相洗脫方法

由圖1可見，4種分析物的保留時間分別為：環(huán)丙沙星26.304 min；達氟沙星28.228 min；恩諾沙星29.822 min；沙拉沙星35.054 min。

圖1 4種FQs的FLD檢測HPLC色譜圖

2 結(jié)果及討論

2.1 分析條件的選擇與優(yōu)化

環(huán)丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星等氟喹諾酮類藥物結(jié)構(gòu)式中含有羧基和哌嗪基，故運用反相色譜分析時，選擇酸性溶液為流動相。流動相中pH值對檢測氟喹諾酮類藥物的分離度影響很大。在不同pH的條件下進行測試，實驗表明，流動相的pH值越低，F(xiàn)Qs的保留時間越長。本方法采用pH=3.0的甲酸水溶液(0.02%)和乙腈作為流動相，不僅能使4種氟喹諾酮類藥物有很好的分離度，而且靈敏度高。4種氟喹諾酮環(huán)丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星熒光檢測波長較為接近，采用280 nm的激發(fā)波長和450 nm的發(fā)射波長。

2.2 標準曲線的繪制

取質(zhì)量濃度分別為0.0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 μg/L系列標準樣品，按實驗方法進行測定，得到不同濃度的色譜圖，按照上述方法，每個濃度平均測定7次，并求取平均值，以質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，回歸方程等參數(shù)見表2。

表2 目標物回歸方程和相關(guān)系數(shù)

2.3 回收率測定

在空白對蝦肉、大閘蟹肉、黑魚肉中添加1 mL的10×10-9、30×10-9、50×10-9的標準樣品，按照1.2樣品處理方法進行處理，在1.3HPLC分析條件下進行測定，求得各喹諾酮的回收量和回收率如表3所示。

表3 方法加標回收率

測得4種FQs在對蝦肉、大閘蟹肉、黑魚肉中的平均回收率分別為79.5%～99.6%、76.8%～101.4%、77.9%～103.2%。滿足樣品分析質(zhì)量控制要求。

2.4 實際樣品的檢測

對取自杭州某市場中對蝦、大閘蟹、黑魚各10份樣品進行分析檢測。根據(jù)色譜條件，以保留時間定性，峰面積定量，樣品加標經(jīng)FLD檢測，其中2份對蝦(DX19003、DX19007)、1份大閘蟹(ZX19006)和2份黑魚(HY19003、HY19009)中檢測到氟喹諾酮類藥物殘留。分析結(jié)果見表4。

表4 樣品檢測FQs藥物殘留 (μg/L)

3 結(jié)論

1) 建立了FLD梯度洗脫的HPLC法檢測水產(chǎn)品中的FQs，優(yōu)化了色譜條件。該方法滿足人工養(yǎng)殖水產(chǎn)品中的FQs檢測要求。4種FQs經(jīng)過柱濃縮回收，回收率均在76.8%～103.2%，分析方法準確可靠。

2) 采集杭州某市場中對蝦、大閘蟹、黑魚各10份樣品，進行定量分析。結(jié)果顯示，個別樣品中檢測到氟喹諾酮類藥物殘留。