作用于細(xì)菌氨酰-tRNA合成酶的抗感染藥物研究進(jìn)展

張碩，李卓榮

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京 100050)

抗菌藥物是人類醫(yī)藥史上最成功的治療藥物，在控制感染性疾病過程中發(fā)揮了重要的作用。但與此同時，抗生素的濫用及新結(jié)構(gòu)骨架抗生素上市的減少，使細(xì)菌耐藥問題變得異常嚴(yán)峻。其中最為突出的是鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、腸桿菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌。在我國細(xì)菌耐藥形勢也是相當(dāng)嚴(yán)峻，2018年11月全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)發(fā)布的《2017年全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測報告(簡要版)》數(shù)據(jù)顯示，2017年全國鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類藥物耐藥率為56.1%，銅綠假單胞菌對碳青霉烯類藥物耐藥率為20.7%，肺炎克雷伯菌對碳青霉烯藥物的耐藥率為9.0%，耐藥率較2016年有所上升，大腸埃希菌對碳青霉烯類藥物的耐藥率為1.5%，甲氧西林耐藥金葡菌全國檢出率為32.2%，萬古霉素耐藥的屎腸球菌檢出率為1.4%，細(xì)菌耐藥已嚴(yán)重威脅人們的健康。因此開發(fā)針對新靶點(diǎn)的抗菌藥物迫在眉睫。近些年來，氨酰-tRNA合成酶作為抗感染藥物靶標(biāo)受到的關(guān)注，由葛蘭素史克公司開發(fā)的莫匹羅星(異亮氨酰-tRNA合成酶抑制劑)為第一個針對此類靶點(diǎn)上市的抗感染藥物[1]，2014年美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)又批準(zhǔn)了另一個針對亮氨酰-tRNA的抑制劑Tavaborole，用于治療真菌引起的甲癬[2]，證明此類靶點(diǎn)具有開發(fā)研究價值。本文將對氨酰-tRNA合成酶的結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制、分類及近年來針對此類靶點(diǎn)研究狀況進(jìn)行系統(tǒng)綜述。

1 氨酰-tRNA合成酶

1.1 氨酰-tRNA合成酶結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及分類 氨酰-tRNA合成酶廣泛存在于古生菌(archaeal)、細(xì)菌和真核細(xì)胞中，在細(xì)胞生長、保持遺傳編碼正確翻譯方面起到重要作用[3]。目前，在生物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn) 20多種氨酰-tRNA合成酶(aaRS)，根據(jù)酶催化中心結(jié)構(gòu)(見圖1)不同、亞基組成的差別可分為Ⅰ類和Ⅱ類。Ⅰ類aaRS的活性中心ATP結(jié)合位點(diǎn)由交替的α-螺旋和β-折疊組成的Rossmann折疊結(jié)構(gòu)構(gòu)成，且包含同源保守氨基酸序列HIGH和 KMSKS。HIGH序列位于第一個β-折疊與相連的α-螺旋之間(鏈A與螺旋B),KMSKS序列位于第五個β-折疊后。根據(jù)Ⅰ類酶的序列的相似性，又可分為以下5個亞類，Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc、Ⅰd和Ⅰe組成，在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中，每一種亞型的酶具有結(jié)構(gòu)的相似性，可以識別結(jié)構(gòu)類似的氨基酸，Ⅰa亞型由異亮氨酰-tRNA合成酶、亮氨酰-tRNA合成酶、蛋氨酰-tRNA合成酶和纈氨酰-tRNA合成酶組成，用以識別帶有疏水性基團(tuán)的氨基酸。Ⅰb亞型由半胱氨酰-tRNA合成酶、谷氨酸-tRNA合成酶和谷酰胺-tRNA合成酶組成，底物氨基酸中帶有電荷。Ⅰc亞型由酪氨酰-tRNA合成酶和色氨酰-tRNA合成酶組成，此類酶可以識別帶有芳香環(huán)的氨基酸底物。由于精氨酰-tRNA合成酶的結(jié)構(gòu)與其他I類酶不同為Ⅰd亞型。目前發(fā)現(xiàn)了2種結(jié)構(gòu)類型的賴氨酰-tRNA合成酶，其中一種與Ⅰb亞型結(jié)構(gòu)相似，但含有特殊的α-螺旋結(jié)構(gòu)，列為Ⅰe亞型。

Ⅱ類aaRS的活性中心由7條反平行的β折疊結(jié)構(gòu)和3段同源序列組成。第一段序列中包含由保守的脯氨酸殘基，第二、三段殘基含有保守的精氨酸殘基，與ATP分子結(jié)合有關(guān)[4]。根據(jù)亞結(jié)構(gòu)的不同，其又可分為Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc三類。Ⅱa亞型由甘氨酰-tRNA合成酶、組氨酰-tRNA合成酶、脯氨酰-tRNA合成酶、蘇氨酰-tRNA合成酶和絲氨酰-tRNA合成酶組成，此類亞型的氨?；磻?yīng)區(qū)域主要位于N-端。Ⅱb亞型由天門冬氨酸-tRNA合成酶、天門冬氨酰-tRNA合成酶、賴氨酰-tRNA合成酶組成，它們在結(jié)構(gòu)上具有相似的C-端氨酰化區(qū)域。Ⅱc亞型由丙氨酰-tRNA合成酶、甘氨酰-tRNA合成酶、苯丙氨酰-tRNA合成酶、吡咯賴氨酰-tRNA合成酶組成。分類見表1。

A.I類酪氨酰-tRNA合成酶(1-222個殘基PDB:3TS1)；B.II 類甘氨酰-tRNA合成酶(α亞單位PDB:3UFG)圖1 氨酰-tRNA合成酶催化中心的結(jié)構(gòu)

雖然在真核細(xì)胞或原核細(xì)胞中相同亞型的酶存在氨基酸序列的相似性，且具有共同的遺傳祖先，但在相同亞型內(nèi)不同的氨酰-tRNA合成酶，仍具有各自的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，存在著二維及三維的結(jié)構(gòu)差別；另外真核細(xì)胞與原核細(xì)胞在酶結(jié)構(gòu)、底物識別機(jī)制上存在較大的差別，即使在同一物種內(nèi)部，相同的氨酰-tRNA合成酶，由于存在酶遺傳的交叉變異，仍然存在結(jié)構(gòu)上的差別，此為設(shè)計具有選擇性的氨酰-tRNA合成酶抑制劑打下了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

1.2 氨酰-tRNA合成酶作用機(jī)制 盡管氨基酸的底物不同，所有的氨酰-tRNA合成酶催化過程可分為兩個過程(見圖2)：首先，酶催化氨基酸的羧基和ATP分子中的5′-磷酸基形成共價鍵，形成氨酰-腺苷(aa-AMP)中間體，從而將特定的氨基酸結(jié)合到ATP分子上。第二步，氨酰-tRNA合成酶結(jié)合相應(yīng)的tRNA，氨基酸殘基從aa-AMP轉(zhuǎn)移到tRNA分子末端3′-腺苷酸的2′-OH或3′-OH上，從而形成氨酰-tRNA。然后脫離合成酶，進(jìn)入核糖體，完成蛋白質(zhì)的合成[5]。

表1 氨酰-tRNA合成酶的分類[4]

圖2 氨酰-tRNA合成酶催化反應(yīng)機(jī)理[6]

正確的氨酰化反應(yīng)依賴于酶對底物氨基酸與相應(yīng)tRNA分子的識別，酶通過以下的機(jī)制保證了tRNA分子與相應(yīng)的氨基酸發(fā)生酰化反應(yīng)，首先酶具有特殊的反應(yīng)位點(diǎn)，用以識別和活化特定的氨基酸，體積較大的氨基酸不能進(jìn)入酶的反應(yīng)位點(diǎn)。另外tRNA分子較大，具有較多的特征元素，相對于小分子，酶發(fā)生錯配的概率更低。另外酶還存在編輯位點(diǎn)以水解錯配的氨基酸。Martinis等[7]報道可分為以下兩種機(jī)制，1是轉(zhuǎn)錄前的編輯，酶可將錯誤?；陌滨?腺苷水解為氨基酸和AMP分子。2是轉(zhuǎn)錄后的編輯，酶可將錯誤?；膖RNA分子水解。酶存在的特殊的催化位點(diǎn)及編輯位點(diǎn)將氨基酸錯配的概率降低到4萬分之1[8]。

2 已上市及處于臨床階段的氨酰-tRNA合成酶抑制劑

針對此類靶點(diǎn)的抑制劑，目前已有3種藥物批準(zhǔn)上市，另外還有藥物處于臨床階段，說明此類蛋白可成為藥物靶點(diǎn)，具有深入的開發(fā)研究價值，首先介紹已上市及處于臨床階段的化合物。

2.1 莫匹羅星 莫匹羅星[1](見圖3，化合物3)是被FDA批準(zhǔn)上市的第一個針對異亮氨酰-tRNA合成酶(Ile-RS)的抑制劑，通過局部給藥，用于治療由金葡菌引起的皮膚感染及預(yù)防金葡菌引起的鼻腔帶菌。它是從熒光假單胞菌中分離得到的天然產(chǎn)物，通過競爭異亮氨酸結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，其對大腸桿菌異亮氨酰-tRNA合成酶的親和力達(dá)到2.5 nmol·L-1。另外，此化合物還表現(xiàn)出了較好的選擇性，其對細(xì)菌的蛋白親和力是人蛋白親和力的8 000倍[9]。莫匹羅星主要針對革蘭陽性菌，對甲氧西林耐藥的金葡菌的最小抑菌濃度(MIC)值為0.25～0.5 μg·mL-1。

2.2 Tavaborole 2014年FDA批準(zhǔn)了Anacor制藥公司開發(fā)的針對亮氨酰-tRNA合成酶(LeuRS)編輯位點(diǎn)的抑制劑藥物Tavaborole(曾用名AN2690，見圖3，化合物4)，屬于硼化合物[2-3]。通過局部給藥用于治療真菌引起的甲癬，其對紅色毛癬菌、須毛癬菌MIC值為1 μg·mL-1，對白色念珠菌的MIC值為0.5 μg·mL-1 [10]。AN2690通過與tRNALeu3′-腺苷的2′和3′氧原子共價結(jié)合于LeuRS的編輯位點(diǎn)，通過阻礙酶結(jié)構(gòu)的翻轉(zhuǎn)起到抑制蛋白質(zhì)合成的作用，從而產(chǎn)生抗真菌作用[3]。

2.3 常山堿衍生物HF HF(見圖3，化合物5)屬于鹵代的常山堿類(從常山植物中分離得到植物堿)衍生物，在許多方面表現(xiàn)出了生物活性，包括抗瘧疾、腫瘤、纖維化和自身免疫等方面。其可通過抑制脯氨酰-tRNA合成酶而起到抗瘧及抗寄生蟲作用，1999年被歐盟批準(zhǔn)用于獸用治療球蟲病[11]，另外研究發(fā)現(xiàn)其可通過抑制Th17細(xì)胞分化從而起到抑制炎癥及對抗自身免疫方面的活性，在2000年被FDA批準(zhǔn)為孤兒藥用于治療與免疫系統(tǒng)相關(guān)的硬皮病[12]。

2.4 REP8839 REP8839 (見圖3，化合物6)為蛋氨酰-tRNA合成酶抑制劑，其對金葡菌的蛋氨酰-tRNA合成酶(MetRS)的親和力達(dá)到10 pmol·L-1。主要針對金葡菌引起的皮膚和傷口感染，其對莫匹羅星耐藥的金葡菌的MIC90值為0.5 μg·mL-1，對25株臨床分離的表葡菌的MIC90值為0.12 μg·mL-1，另外對48株分離的釀膿鏈球菌MIC90值為0.12～0.25 μg·mL-1，而莫匹羅星對其中耐藥菌株MIC90值為8 μg·mL-1 [13]，其主要對抗皮膚感染的金葡菌與釀膿鏈球菌，另外不僅對甲氧西林、莫匹羅星耐藥的金葡菌，對萬古霉素中介及耐藥的菌株也表現(xiàn)較好活性，目前正處于臨床Ⅰ期。

圖3 已上市或處于臨床階段的氨酰-tRNA合成酶抑制劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)

3 氨酰-tRNA合成酶抑制劑的研究發(fā)現(xiàn)方式

除上述介紹的幾種已上市或處于臨床階段的氨酰-tRNA合成酶抑制劑外，人們也在不斷發(fā)現(xiàn)針對此類靶點(diǎn)的新化合物，大體可分成3種途徑：①通過微生物發(fā)酵，天然產(chǎn)物修飾策略發(fā)現(xiàn)了一批具有抗菌活性的化合物，包括莫匹羅星，通過對天然產(chǎn)物進(jìn)行全細(xì)胞篩選，確定了許多針對氨酰-tRNA合成酶的抑制劑具有抗菌活性；②通過模擬酶底物方式發(fā)現(xiàn)高親和力化合物；③通過酶活及計算機(jī)輔助設(shè)計手段得到親和力骨架，然后進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，已發(fā)現(xiàn)新骨架的抗菌化合物。以下分別介紹上述3種策略的研究情況。

3.1 微生物發(fā)酵、天然產(chǎn)物修飾途徑

3.1.1 莫匹羅星及結(jié)構(gòu)類似物 1971年，F(xiàn)uller等[14]報道了從熒光假單胞菌的代謝產(chǎn)物中分離得到了假單胞菌酸A，即莫匹羅星。作為已上市的抗菌藥物，目前關(guān)于莫匹羅星耐藥的金葡菌也已報道，可分為高耐藥(MIC>512 μg·mL-1)，基于菌體產(chǎn)生mupA基因，從而獲得第二種異亮氨酰-tRNA合成酶引起[15]，及中度耐藥(MIC為4～512 μg·mL-1)，由異亮氨酰-tRNA合成酶的點(diǎn)突變引起[16]，與此同時，關(guān)于莫匹羅星的結(jié)構(gòu)改造也在繼續(xù)，結(jié)構(gòu)中的α、β不飽和酯結(jié)構(gòu)影響了系統(tǒng)給藥的代謝穩(wěn)定性，酯基水解后抗菌活性消失，Brown等[17]根據(jù)生物電子等排體將α、β不飽和酯替換為不飽和的五元芳環(huán)，其中化合物7、8 (見圖4)的MIC值為2～8 μg·mL-1，不如莫匹羅星。Broom等[18]在惡唑環(huán)的基礎(chǔ)上連上帶硝基的芳環(huán)結(jié)構(gòu)，提高了莫匹羅星的活性并拓展了抗菌譜，化合物9、10(見圖4)對莫匹羅星耐藥的脆弱擬桿菌、金葡菌C37和F89表現(xiàn)出了一定活性。對莫匹羅星耐藥金葡菌表現(xiàn)出活性反映其作用機(jī)制并非僅通過抑制細(xì)菌的異亮氨酰-tRNA合成酶發(fā)揮抗菌作用，進(jìn)一步機(jī)理研究顯示，該硝基化合物通過細(xì)菌的NADH和NADPH-依賴的還原酶轉(zhuǎn)變成活性產(chǎn)物而進(jìn)一步起到抑菌作用。

圖4 莫匹羅星結(jié)構(gòu)改造物

3.1.2 疏螺體素(BN) 疏螺體素 (見圖5，化合物11)屬于蘇氨酰-tRNA合成酶抑制劑，1949年Berger等[19]在鏈霉菌屬的發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到，它能強(qiáng)有力的抑制細(xì)菌和真核細(xì)胞的ThrRS。BN具有十八元環(huán)的大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，可通過誘導(dǎo)契合的機(jī)制結(jié)合于與ThrRS的中心活化位點(diǎn)的關(guān)鍵區(qū)域，研究發(fā)現(xiàn)其可占據(jù)蘇氨酰-tRNA合成酶部分氨基酸位點(diǎn)、ATP、tRNA及輔助位點(diǎn)，從而起到抑制ThrRS的作用，此化合物具有強(qiáng)的抗瘧活性，半抑制濃度(IC50)值達(dá)到0.97 nmol·L-1，其活性與臨床使用的青蒿素甲醚、氯喹相似[20]。

3.1.3 吲哚霉素 吲哚霉素(見圖5，化合物12)是1960年Marsh等[21]首次報道的從白色鏈霉菌中分離得到的一種抗生素。其結(jié)構(gòu)中含有色氨酸結(jié)構(gòu)，提示通過細(xì)菌的芳香氨基酸攝入系統(tǒng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，競爭結(jié)合色氨酰-tRNA合成酶(Trp-RS)而起到抗菌作用。吲哚霉素對革蘭陽性菌和少數(shù)革蘭陰性菌表現(xiàn)出一定的抑菌活性，其對32株甲氧西林敏感的金葡菌的MIC值為0.125～0.5 μg·mL-1，對28株甲氧西林耐藥的金葡菌的MIC值為(0.125～2 μg·mL-1)，對7株萬古霉素中介的金葡菌的MIC值為(0.125～2 μg·mL-1)，對莫匹羅星和夫西地酸耐藥的金葡菌也表現(xiàn)出較好的抑菌活性[22]。此外，研究發(fā)現(xiàn)吲哚霉素還具有良好的抑制幽門螺桿菌的活性[23]。目前，有報道在灰色鏈霉菌上發(fā)現(xiàn)了由于TrpRS上的 (H43N)點(diǎn)突變引起的耐藥性。在吲哚霉素的改造方面，Witty 等[24]在將6位的甲基變?yōu)橐一?、甲硝基及羧酸酯基后活性大幅度下降，?位引入羥基活性可以保持。

3.1.4 創(chuàng)新霉素 創(chuàng)新霉素(見圖5，化合物13)是我國科研工作者于1976年首先在濟(jì)南放線菌3945中發(fā)現(xiàn)的全新結(jié)構(gòu)的抗生素[25]，經(jīng)驗證其屬于色氨酰-tRNA合成酶抑制劑，具有中等抗菌活性[26]，其主要對革蘭陽性菌和少數(shù)革蘭陰性菌具有抑制作用，對金色葡萄球菌、痢疾桿菌、大腸桿菌及流行性感冒桿菌具有抗菌作用。其對金色葡萄球菌的MIC值為1.56～3.125 μg·mL-1，對大腸桿菌1515的MIC值為3.125～6.25 μg·mL-1。在結(jié)構(gòu)改造方面，蘇盛惠等[25]合成若干羧酸衍生物，包括酯及酰胺結(jié)構(gòu)，另外對吲哚環(huán)上氮上進(jìn)行取代衍生化，衍生物的體外抗菌活性表明，除N-甲酰基取代衍生物與創(chuàng)新霉素活性相當(dāng)外，其他衍生物均無明顯的抗菌活性。戚天慶等合成了去硫創(chuàng)新霉素，發(fā)現(xiàn)其也是通過抑制Trp-RS起到抗菌作用，其對E.coliB的抗菌活性與創(chuàng)新霉素相當(dāng)[27]。Brown等[28]對創(chuàng)新霉素新行了開環(huán)，擴(kuò)環(huán)以及羧基上的修飾得到一個對金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌和卡塔莫拉菌活性較好的內(nèi)酯化合物。

3.1.5 Microcin C 1976年Asensio等[29]首先報道了Microncins為來源于大腸桿菌的具有抗菌活性的可透析的抗菌物質(zhì)。Garcia-Bustos 等[30]首次確定了其中活性成分Microncin C (見圖5，化合物14)分子中包含有7肽結(jié)構(gòu)，對部分革蘭陰性菌表現(xiàn)出了一定的抑菌活性，包括沙門氏屬、克雷伯屬、埃希氏菌屬等。研究發(fā)現(xiàn)此化合物利用7肽鏈的木馬策略，通過敏感菌株的YejABEF基因編碼的內(nèi)膜ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在氨肽酶的作用下分解為天門冬氨酰-腺苷類似物，起到抑制天門冬氨酰-tRNA合成酶的作用。Vondenhoff等[31]利用Microncin C的攝入機(jī)制，改變肽鏈上第7位氨基酸，開發(fā)了合成Microncin C 類似物的方法，并研究了此類化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)7位氨基酸對轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的識別具有重要影響，其中極性氨基酸如天門冬氨酸、賴氨酸時活性優(yōu)于非極性氨基酸，另外7位為甘氨酸也表現(xiàn)出活性。此類似物的合成方法，為利用木馬策略改善化合物的攝入提供了借鑒。

3.1.6 白霉素 白霉素 (見圖5，化合物15) 是1947年Reynolds等[32]報道的從鏈霉菌屬中發(fā)酵分離得到的抗生素，目前已發(fā)現(xiàn)了3種成分δ1、δ2、ε[33]，為另一個通過木馬策略進(jìn)入細(xì)菌的氨酰-tRNA合成酶抑制劑，其通過連接的異羥肟酸鐵載體進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部，水解釋放出由硫取代的呋喃糖的腺苷類似物，研究發(fā)現(xiàn)其對蘇氨酰-tRNA合成酶的抑制活性達(dá)到8 nmol·L-1。Paulsen等[34]研究發(fā)現(xiàn)其硫取代的糖的結(jié)構(gòu)對活性至關(guān)重要，將其改為氧取代后活性消失。2018年Lin等[35]首次報道了白霉素的全合成，其中白霉素δ2對臨床分離的肺炎鏈球菌的MIC值達(dá)到10 ng·mL-1，對臨床分離金葡菌的MIC值為小于0.25 μg·mL-1。另外對大腸桿菌ATCC 25922 MIC值也達(dá)到0.25 μg·mL-1。

3.1.7 Ascamycin Ascamycin(見圖5，化合物16)是由鏈霉菌屬發(fā)酵產(chǎn)生的核苷類抗生素，1984年Isono等[36]首次報道了Ascamycin的分離及結(jié)構(gòu)。Ascamycin分子中含有2-氯腺嘌呤結(jié)構(gòu)，屬于氨酰-腺苷類似物，研究發(fā)現(xiàn)其可選擇性的抑制百葉枯病菌和柑橘潰瘍病菌的苯丙氨酰-tRNA合成酶，而對大腸桿菌沒有表現(xiàn)出活性。然而去丙氨酰Ascamycin除對上述兩株菌具有抗菌活性外，對部分革蘭陰性菌和陽性菌均表現(xiàn)出一定的活性，分析脫去丙胺?；螅衔锬芨玫赝高^細(xì)菌外膜從而表現(xiàn)出更廣的抗菌譜[37]。

圖5 微生物發(fā)酵來源的氨酰-tRNA合成酶抑制劑

3.2 氨酰-tRNA合成酶底物類似物 近些年來，通過模擬底物的方式進(jìn)行氨酰-tRNA合成酶抑制劑的設(shè)計與發(fā)現(xiàn)也取得一定進(jìn)展。酶底物氨基酸或中間體氨酰-腺苷類似物，由于結(jié)構(gòu)相似性，可競爭性結(jié)合相應(yīng)的氨酰-tRNA合成酶，從而表現(xiàn)出酶抑制及抗菌活性。由此許多非天然氨基酸及類似物，及氨酰-腺苷類似物成為潛在具有抗菌作用的化合物。

3.2.1 氨基酸類似物

3.2.1.1 呋喃霉素 呋喃霉素(見圖6，化合物17)屬于非天然的α氨基酸，1967年Katagiri等[38]報道其可競爭性的結(jié)合異亮氨酰-tRNA合成酶(IleRS)，從而具有抑制細(xì)菌生長的作用，在化學(xué)合成培養(yǎng)基條件下對副痢疾志賀菌、副傷寒沙門菌的MIC值為2～5 μg·mL-1，對枯草桿菌PCI219的MIC值為1 μg·mL-1，但在營養(yǎng)瓊脂中測定卻未表現(xiàn)出抗菌活性。

3.2.1.2 順戊霉素 1989年Konishi等[39]報道了順戊霉素(見圖6，化合物18)為從蠟樣芽孢桿菌發(fā)酵液中分離得到具有抗真菌活性的化合物，其結(jié)構(gòu)為(1R,2S)-2-氨基環(huán)戊烷-1-羧酸，結(jié)構(gòu)與脯氨酸類似，其可競爭性的結(jié)合脯氨酰-tRNA合成酶(ProRS)，從而起到抑菌作用，具有較好的抑制真菌的作用，其對臨床分離的白色念珠菌的IC50及IC100濃度分別為6.3～12.5 μg·mL-1及6.3～50 μg·mL-1 [39-40]。

3.2.1.3 艾芬凈噴 自從天然發(fā)酵產(chǎn)物順戊霉素被發(fā)現(xiàn)具有抗真菌活性以后，德國的拜耳公司展開了對合成的環(huán)狀的β-氨基酸衍生物抗真菌活性的研究[41]，其中艾芬凈噴(見圖6，化合物19)為抗菌活性最好的化合物，為抗真菌的異亮氨酰-tRNA合成酶(IleRS)抑制劑，其為特殊的β-氨基酸結(jié)構(gòu)，1R,2S構(gòu)型對其活性至關(guān)重要，其可通過特殊的支鏈氨基酸的滲透酶主動轉(zhuǎn)運(yùn)至白色念珠菌內(nèi)，濃度可提高200倍，在菌體內(nèi)通過抑制異亮氨酰-tRNA合成酶起到抑菌活性，對白色念珠菌BSMY212的MIC90值為2 μg·mL-1 [42]。

一些氨基酸類似物也具有抗生素的作用，例如硫代異亮氨酸(見圖6，化合物20)、O-甲基蘇氨酸(見圖6，化合物21)，刀豆氨酸(見圖6，化合物22)等，一方面通過競爭性的與氨酰-tRNA的結(jié)合，從而抑制正常蛋白質(zhì)的合成，起到抑菌作用。另一方面由于它們被誤合成入肽鏈，導(dǎo)致蛋白活性的減弱或消失[43]。

圖6 模擬氨基酸底物的氨酰-tRNA合成酶抑制劑

3.2.2 氨酰-腺苷類似物 研究發(fā)現(xiàn)氨酰-腺苷中間體對酶的親和力可達(dá)到nmol級，高于底物氨基酸和ATP2-3個數(shù)量級[44]，因此通過基于活性中間體氨酰-腺苷(aa-AMP)結(jié)構(gòu)的理性設(shè)計，成了開發(fā)此靶點(diǎn)抑制劑的研究熱點(diǎn)。

由于活性中間體氨酰-腺苷具有高能量的?；?磷酸酯鍵，此類結(jié)構(gòu)并不穩(wěn)定，許多天然來源的aaRS抑制劑也將不穩(wěn)定的?；?磷酸酯linker替換成了穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，如Microcin C和Agrocin 84(見圖7，化合物23)將?；?磷酸酯(見圖7，化合物24)替換為氨酰-磷酸酯，Ascamycin將?；?磷酸酯替換為氨酰-磺酸酯鍵。

通過理性設(shè)計改造aa-AMP類似物，集中于提高此類化合物的化學(xué)穩(wěn)定性、與靶蛋白的親和力、體內(nèi)的親和力及選擇性。目前許多研究已將aa-AMP分子中不穩(wěn)定的?；?磷酸酯鍵通過生物電子等排體替換為穩(wěn)定的基團(tuán)，如Bernier等[45]通過谷氨酰胺還原，然后與腺苷反應(yīng)得到linker為氨烷基-磷酸酯的化合物，評價其對大腸桿菌谷氨酰胺-tRNA合成酶(GlnRS)的抑制劑活性，發(fā)現(xiàn)此化合物對谷氨酰胺的抑制常數(shù)為280 nmol·L-1。

Forrest等[46]合成了linker分別為氨烷基-磷酸酯(見圖7，化合物25)和氨酰-磺酸酯的精氨酸、組氨酸和蘇氨酸的腺苷類似物，并評價其對金葡菌相應(yīng)氨酰-tRNA合成酶的抑制活性，發(fā)現(xiàn)兩類linker的腺苷類似物對I類酶精氨酰-tRNA的IC50值達(dá)到7.5 nmol·L-1和4.5 nmol·L-1，對II類酶的活性氨酰-磺酸酯類優(yōu)于氨烷基-磷酸酯。

Lee等[47]研究了腺苷與氨基酸間的linker為酯基(見圖7，化合物26)和異羥肟酸基(見圖7，化合物27)的氨酰-腺苷類似物對大腸桿菌蛋氨酰-tRNA合成酶與異亮氨酰-tRNA合成酶親和力的影響，酯基linker對蛋氨酰-tRNA的IC50為3.6 μmol·L-1，優(yōu)于對異亮氨酰-tRNA合成酶的親和力。

此外linker結(jié)構(gòu)分別為酰胺鍵[48](見圖7，化合物28)、磺酰胺[49](見圖7，化合物29)、氨基磺酸酯[50](見圖7，化合物30)、N-羥基磺酰胺[51](見圖7，化合物31) 、羥肟[47，52]等也相繼被報道。

圖7 氨酰-腺苷類似物結(jié)構(gòu)

Brown等[50]建立了莫匹羅星與Ile-RS相互作用模型，通過研究發(fā)現(xiàn)氨基酸與糖linker的長短對蛋白的結(jié)合具有決定性的影響，改變linker的長度會明顯降低親和力；另外將連接的氧原子被亞甲基或氮原子取代也會影響負(fù)電荷密度從而大幅度降低親和力。

2015年Gadakh等[44]通過改變腺苷與氨基酸linker的連接方式，省去了與糖連接的氧原子，將氨酰-磷酸酯變?yōu)榘滨?磺胺結(jié)構(gòu)，提高了化合物的穩(wěn)定性。其中化合物32 (見圖8) 對大腸桿菌表現(xiàn)出一定的抑制活性，說明此類化合物可以透過細(xì)菌外膜，但由于氧原子省去，減少了與酶的相互作用，降低了親和力。

此類氨酰-磺胺類結(jié)構(gòu)被證明是對氨酰-tRNA合成酶有效的骨架，但因體內(nèi)缺乏選擇性而影響了此類化合物的應(yīng)用。另外，由于此類結(jié)構(gòu)化合物中腺苷3位的N容易與糖的5′位發(fā)生親核反應(yīng)，影響了此類結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性及后續(xù)開發(fā)研究。

2018年Zhang等[53]報道保留腺苷與氨基酸linker的氨基磺酸酯結(jié)構(gòu)，改變堿基的母核結(jié)構(gòu)，將堿基改為3位脫去氮原子的腺苷，避免了腺苷3位N的親核副反應(yīng)的發(fā)生，通過連接不同的氨基酸合成了一系列化合物33 (見圖8) 對Ⅰ類和Ⅱ類的aaRS表現(xiàn)出不同的抑制活性，對Ⅰ類酶的親和力明顯優(yōu)于Ⅱ 類酶。但此類化合物的抗菌活性并不理想。

圖8 氨酰-腺苷類似物改造物結(jié)構(gòu)式

雖然此類化合物在體外表現(xiàn)出了較好的酶抑制活性，但其抗菌活性往往不佳，可能是由于化合物透細(xì)菌外膜不佳引起。如何提高化合物的攝入，Microcin C和白霉素的木馬策略為此類化合物的進(jìn)一步改造提供了借鑒。另外此類結(jié)構(gòu)對哺乳動物細(xì)胞與病原菌的選擇性也是開發(fā)研究需要考慮的問題。

3.3 酶活或計算機(jī)輔助設(shè)計方式 通過酶活或計算機(jī)輔助設(shè)計得到針對此類靶點(diǎn)的苗頭化合物，然后進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾得到抗菌活性的化合物也是一種研究開發(fā)策略。

2002年Jarvest等[54]報道，通過對酶活篩選得到了針對金葡菌蛋氨酰-tRNA合成酶(MetRS)抑制劑，其具有喹諾酮母核結(jié)構(gòu)，但其對金葡菌未表現(xiàn)出抗菌活性，通過對苗頭化合物的改造，得到了由喹諾酮通過丙二胺linker連接四氫喹啉結(jié)構(gòu)化合物，化合物34、35(見圖9)對酶的IC50值小于20 nmol·L-1，其中化合物34對31株金葡菌的MIC90值為0.5 μg·mL-1，另外對10株腸球菌的MIC90值為0.03 μg·mL-1，化合物35對金葡菌感染鼠腹股溝膿瘡感染模型實驗中，也表現(xiàn)了較好的抑菌活性，其靜脈注射21 mg·kg-1給藥劑量與靜脈注射50 mg·kg-1的紅霉素效果相當(dāng)。

2004年Beyer等[55]報道了苯基-噻唑脲-磺胺類化合物36(見圖9)對來自大腸桿菌、流感嗜血桿菌的苯丙氨酰-tRNA合成酶(phe-RS)的IC50值達(dá)到nmol水平，此外還具有良好的細(xì)菌和哺乳細(xì)胞選擇性。其體外抗菌活性表現(xiàn)出了一定的苯丙氨酸依賴性，對缺乏苯丙氨酸的S.aureus、H.influenzae的MIC值為0.4 μg·mL-1；S.pneumoniae的MIC值為0.8 μg·mL-1。且肺炎雙球菌的依賴性低于金葡菌，在S.pneumoniae感染的大鼠敗血癥模型的體內(nèi)試驗中，化合物36表現(xiàn)出了較好的抑菌效果。在注射給藥100 mg·kg-1于S.pneumoniae感染的大鼠，在感染后0.5～3 h，肺、腎臟、脾臟的CFU下降2至3 log10單位。

2013年Teng 等[56]報道了基于結(jié)構(gòu)設(shè)計的選擇性細(xì)菌蘇氨酰-tRNA合成酶抑制劑。以化合物與酶的共晶結(jié)構(gòu)為指導(dǎo)，用氨基喹啉環(huán)連苯結(jié)構(gòu)替代腺苷結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)能較好誘導(dǎo)酶的關(guān)閉構(gòu)型。且與ser517缺乏氫鍵作用的化合物具有較好的原核細(xì)胞與真核細(xì)胞選擇性。化合物的活性較先導(dǎo)物有較大的提高，其中化合物37(見圖9)對流感嗜血桿菌的MIC為4 μg·mL-1，且對于外排泵敲除的大腸桿菌也表現(xiàn)出一定的活性。

呋喃酮類結(jié)構(gòu)存在于許多天然產(chǎn)物及合成中，其中許多顯示出抗氧化、抗炎癥反應(yīng)等活性，2011年Xiao等[57]報道了具有3-芳基-4-烷基胺呋喃酮結(jié)構(gòu)的化合物對金葡菌ATCC25923、枯草桿菌ATCC6633及白色念珠菌ATCC10231具有一定的抑菌活性，其中化合物38(見圖9)，對金葡菌的MIC50值為0.42 μg·mL-1，優(yōu)于卡那霉素，通過酶活驗證其對酪氨酰-tRNA合成酶具有較強(qiáng)的抑制作用，其IC50值為(0.12± 0.04)μmol·L-1。同年，Xiao等[58]又報道了3-芳基-4-芳氨基呋喃酮類化合物作為酪氨酰-tRNA合成酶抑制劑表現(xiàn)了一定的抑菌活性，化合物39(見圖9)對金葡菌ATCC25923的MIC50值為0.06 μg·mL-1，對枯草桿菌ATCC6633的MIC50值為1.2 μg·mL-1。2013年Wang等[59]通過改變4位芳基與呋喃酮的linker，使呋喃酮類衍生物對部分革蘭陰性菌表現(xiàn)出了一定的抑制作用，其中化合物40(見圖9)對綠膿桿菌ATCC27853的MIC50值為1.5 μg·mL-1，大腸桿菌ATCC35218的MIC50值為4.3 μg·mL-1。分子對接驗證此類化合物與細(xì)菌酪氨酰-tRNA合成酶具有很好結(jié)合。

2014年Sun等[60]報道了(萘亞甲基)噻吩酮類化合物，通過篩選其對金葡菌酪氨酰-tRNA合成酶的抑制活性，得到了IC50<20 μmol·L-1的化合物，通過篩選其對金葡菌ATCC25923、枯草桿菌ATCC6633及陰性菌銅綠假單胞ATCC13525，大腸桿菌ATCC 35218的活性，發(fā)現(xiàn)化合物41(見圖9)對金葡菌具有較好的抑菌活性，MIC50值為0.21 μg·mL-1，對枯草桿菌的MIC50值為3.66 μg·mL-1，對革蘭陰性菌未表現(xiàn)出抑菌活性。分子對接顯示其與酪氨酰-tRNA合成酶具有很好結(jié)合，并提示在苯環(huán)上引入親水性取代基可進(jìn)一步提高親和力。

圖9 通過酶活篩選或計算機(jī)輔助設(shè)計得到的氨酰-tRNA合成酶抑制劑

4 結(jié)論

面對日益嚴(yán)峻的細(xì)菌耐藥問題，臨床迫切期望開發(fā)新靶點(diǎn)的抗菌藥物，隨著莫匹羅星及Tavaborole等的上市，證明氨酰-tRNA合成酶可作為抗感染藥物的靶標(biāo)。許多微生物發(fā)酵產(chǎn)物證明可通過抑制氨酰-tRNA合成酶而起到抗菌作用，為進(jìn)一步的藥物開發(fā)提供了結(jié)構(gòu)豐富的化合物寶庫。日益興起的計算機(jī)虛擬篩選技術(shù)，為得到新的結(jié)構(gòu)片段及理性設(shè)計提供了有力工具，提高了獲得針對此類靶點(diǎn)新骨架化合物的效率。如何進(jìn)一步提高天然發(fā)酵產(chǎn)物的抗菌活性，拓展抗菌譜；另外提高酶底物類似物的透膜性質(zhì)及選擇性；利用好虛擬篩選、計算機(jī)輔助設(shè)計等手段，指導(dǎo)活性片段發(fā)展為新骨架的抗感染藥物，成為針對此靶點(diǎn)進(jìn)一步研究開發(fā)的挑戰(zhàn)。相信隨著對原核生物氨酰-tRNA合成酶晶體結(jié)構(gòu)功能研究的深入，新的研發(fā)技術(shù)和工具的應(yīng)用，會有更多的針對此類靶點(diǎn)的抗感染藥物上市。