苧麻根際加德擬鞘線蟲的形態(tài)和分子鑒定

宋志強，楊喜愛，張曉偉，郭兵，肖愛平，肖清明，梅時勇

(中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所，湖南 長沙 410205)

擬鞘線蟲(HemicriconemoidesChitwood & Birchfield，1957)是一類植物根系遷移性外寄生線蟲，主要分布于全世界較溫暖地區(qū)，包括非洲、美洲、南歐、澳大利亞、東亞、南亞、東南亞等[1-2]。目前世界上報道擬鞘線蟲的種類已達55種，我國記載的有18種[2]，可寄生和危害水稻、玉米、柑橘、芒果、荔枝、龍眼、香蕉、葡萄、枇杷、番石榴等作物和果樹的根系，導致根系發(fā)育不良，植株生長衰退[3-4]。此外，擬鞘線蟲侵染根系造成的傷口有利于真菌、細菌等植物病原物的侵染，加重對植物的危害。

苧麻(Boehmerianivea)俗稱“中國草”，是一種多年生宿根性旱地草本纖維作物，我國苧麻種植面積和產(chǎn)量均占全世界總種植面積和產(chǎn)量的90%以上[5]。苧麻全株均可利用，目前主要應用于纖維紡織、動物飼料、食用菌培養(yǎng)基質、環(huán)保型麻地膜、土壤重金屬污染修復、燃料乙醇、造紙等方面[6]。盡管我國苧麻栽培歷史悠久，但目前尚未見擬鞘線蟲為害苧麻的報道。

2018年11月，作者在湖南省益陽市苧麻線蟲病的調查過程中，從苧麻根際土壤中分離到一種擬鞘線蟲，通過形態(tài)學和分子生物學相結合的方法對該線蟲進行鑒定，以明確苧麻根際擬鞘線蟲的種類，從而為該病害的準確診斷和有效防治提供科學指導。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和線蟲分離

樣品采自湖南省益陽市沅江市榨南湖村的苧麻根際，取樣深度為5～25 cm，每份樣品約500 g，放入封口袋中，標明寄主植物、采樣地點、采樣時間等，帶回實驗室。采用淺盤法分離土壤中的線蟲。

1.2 形態(tài)學鑒定

將分離獲得的線蟲經(jīng)溫熱殺死后，制成臨時玻片，在尼康顯微鏡(Nikon E200型)下對線蟲的整體形態(tài)和內部結構進行觀察和拍照，采用de Man公式對線蟲進行形態(tài)測計。

1.3 分子生物學鑒定

1.3.1 線蟲DNA提取

參照宋志強等[7]的方法提取單條線蟲的DNA。在體視顯微鏡下，用挑針挑取單條線蟲放入含有8 μL ddH2O和1 μL 10×PCR buffer(Mg2+free)的0.2 mL PCR管中；將PCR管放入液氮中冷凍1 min后，再置于85 ℃下2 min，重復5次；向PCR管中加入1 μL 1 mg/mL蛋白酶K，56 ℃孵育15 min，95 ℃加熱10 min，獲得的DNA提取液可直接用于PCR擴增或者置于-20 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR擴增

利用通用引物18s(5′-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3′)和26s(5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG -3′)[8]以及D2A(5′-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3′)和D3B(5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′)[9]分別擴增線蟲的rDNA-ITS區(qū)和28S rDNA-D2/D3區(qū)序列。PCR反應體系為25 μL，其中10×EasyTaqbuffer(含Mg2+)2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，10 μmol/L正反向引物各1 μL，5 U/μLEasyTaqDNA聚合酶0.5 μL，模板DNA 5 μL，補足ddH2O至25 μL。反應程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.3.3 PCR產(chǎn)物的克隆及測序

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳切膠回收、純化后，與克隆載體pEASY-T1(北京全式金生物技術有限公司)連接，再轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中后，挑取陽性克隆送至北京擎科生物科技有限公司湖南分公司測序。測序獲得的序列經(jīng)BioXM 2.6軟件拼接編輯后，提交至GenBank數(shù)據(jù)庫獲取序列號。

1.3.4 系統(tǒng)進化樹構建

從GenBank數(shù)據(jù)庫下載擬鞘屬線蟲的rDNA-ITS區(qū)和28S rDNA-D2/D3區(qū)序列，利用MEGA X軟件中的ClustalW程序對序列進行比對，采用鄰接法(neighbor-joinning method，NJ)構建系統(tǒng)進化樹，并用Bootstrap值分析分支聚類的可靠性。

2 結果與分析

2.1 形態(tài)學鑒定

從苧麻根際土壤中僅分離到擬鞘線蟲的雌蟲，未見到雄蟲。雌蟲形態(tài)特征及形態(tài)測計值見圖1、表1。雌蟲蟲體圓柱形，熱殺死后稍向腹面彎曲。體長387.0～464.8 μm，體環(huán)89～98個，環(huán)較寬大，平滑，不后翻，體中部體環(huán)寬3.5～5.6 μm(圖1-A)。頭部頂端平圓，有唇盤，唇環(huán)2個?？卺槹l(fā)達，長63.6～74.7 μm，占13～22個體環(huán)，口針基部球前緣突起。具典型的環(huán)形食道，食道前體部與中食道球融合，中食道球發(fā)達，后食道腺梨形，與腸分界清楚。排泄孔位于腸的前端，到頭端的距離為92.6～130.3 μm，體環(huán)23～30個(圖1-B)。陰道向內前傾，單卵巢，前伸。陰門橫裂，距肛門3～4個體環(huán)，距尾端9～13個體環(huán)。肛門距尾端5～10個體環(huán)。尾部呈圓錐形，末端鈍圓(圖1-C～F)。

本研究從苧麻根際分離得到的擬鞘線蟲雌蟲的形態(tài)特征和測計值與楊意伯等[4]和Decraemer等[10]描述的加德擬鞘線蟲基本吻合，故將此擬鞘線蟲群體初步鑒定為加德擬鞘線蟲[Hemicriconemoidesgaddi(Loos, 1949)Chitwood & Birchfield, 1957]。該線蟲隸屬于墊刃目(Tylenchida)，墊刃亞目(Tylenchina)，環(huán)總科(Criconematoidea)，環(huán)科(Cricomenatidea)，環(huán)亞科(Criconematinae)，擬鞘線蟲屬(Hemicriconemoides)。

注：A：整體；B：體前部；C～F：尾部圖1 加德擬鞘線蟲雌蟲的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of Hemicriconemoides gaddi female

表1 加德擬鞘線蟲益陽群體與文獻描述群體的雌蟲測計值

Table 1 Morphometrics of females ofHemicriconemoidesgaddiYiyang population and the previous described population

測計特征益陽群體福州群體[4]巴布亞新幾內亞群體[10]n203735L/μm413.5±19.6(387.0～464.8)481.0±26.6 (437.1～464.8)400.0±40.8(330.0～530.0)W/μm29.6±2.0 (27.2～35.7)29.5±1.4 (24.4～34.7)33.0±3.1(23.0～38.0)Stylet/μm67.6±2.8(63.6～74.7)67.9±3.7 (61.4～75.6)68.7±3.6(61.0～75.0)Tail/μm26.9±1.1 (25.0～28.2)28.3±4.0 (23.8～33.1)25.9±4.9(17.0～39.0)a14.0±1.0 (12.1～15.8)16.3±1.8 (14.2～18.6)12.3±1.7 (9.4～17.0)b3.8±0.5 (3.4～4.3)4.1±0.3(3.6～4.4)2.9±0.6(2.4～4.2)c15.4±2.0 (14.2～17.9)17.1±2.1(15.3～20.6)15.8±2.2 (11.2～20.0)V/%89.7±0.7 (88.7～91.2)89.7±0.6(88.7～90.6)89.3±1.6(83.4～92.0)Ex.P/μm114.4±8.5(92.6～130.3)138.7±9.6(120.5～151.4)111.4±3.2(86.0～143.0)VL/VB1.8±0.2(1.7～2.1)2.0±0.3(1.7～2.4)1.9±0.2(1.5～2.2)

續(xù)表1

測計特征益陽群體福州群體[4]巴布亞新幾內亞群體[10]R94.5±2.3(89.0～98.0)103.0±5.0(96.0～109.0)104.8±3.2(99.0～110.0)RB4.7±0.5(3.5～5.6)3.2±0.2(3.0～3.6)-Rst16.1±2.0(13.0～22.0)18.0±1.0(16.0～19.0)-Rex27.0±1.8(23.0～30.0)31.0±2.0(28.0～34.0)32.2±1.2(30.0～35.0)RV10.9±1.0(9.0～13.0)13.0±1.0(12.0～15.0)11.5±1.3(9.0～16.0)Ran7.1±1.0(5.0～10.0)9.0±1.0(8.0～10.0)-RVan3.8±0.4(3.0～4.0)5.0±1.0(4.0～6.0)4.3±1.1(3.0～8.0)

注：n=樣本數(shù)，L=體長，W=最大體寬，Stylet=口針長，Tail=尾長，a=體長/最大體寬，b=體長/頭端至食道與腸連接處的距離，c=體長/尾長，V=陰門至頭端的距離/體長×100，Ex.P. =排泄孔至頭端的距離，VL/VB=陰門至尾端的距離/陰門處體寬，R=體環(huán)數(shù)，RB=蟲體中部的體環(huán)寬度，Rst=唇盤至口針基部球之間的體環(huán)數(shù)，Rex=唇盤至排泄孔后第一環(huán)之間的體環(huán)數(shù)，RV=陰門至尾端之間的體環(huán)數(shù)，Ran=肛門至尾端之間的體環(huán)數(shù)，RVan=陰門至肛門之間的體環(huán)數(shù)。

2.2 分子生物學特征分析

測序結果表明，擬鞘線蟲益陽群體rDNA-ITS區(qū)的擴增片段長度為997 bp(GenBank登錄號：MK050499)，28S rDNA-D2/D3區(qū)片段長度為768 bp(GenBank登錄號：MK050500)。序列分析結果顯示，該群體的rDNA-ITS區(qū)序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的加德擬鞘線蟲福州群體(KC520471)相似性達97%，與其它擬鞘屬線蟲種的同源性約為82%～91%。該群體的28S rDNA-D2/D3區(qū)序列與加德擬鞘線蟲福州群體(KC520470)相似性為97%，與其它種的序列同源性為86%～95%。從基于rDNA-ITS區(qū)和28S rDNA-D2/D3區(qū)序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹可知(圖2、 3)，該群體與加德擬鞘線蟲處于同一進化分支上，與其它擬鞘屬線蟲進化關系較遠。

綜合形態(tài)學特征比較和分子生物學特征分析，從苧麻根際分離到的擬鞘線蟲最終鑒定為加德擬鞘線蟲。

圖2 基于rDNA-ITS區(qū)序列構建的擬鞘屬線蟲系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of Hemicriconemoides species based on rDNA-ITS sequences

圖3 基于28S rDNA-D2/D3區(qū)序列構建的擬鞘屬線蟲系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of Hemicriconemoides species based on 28S rDNA-D2/D3 sequences

3 討論與結論

加德擬鞘線蟲益陽群體的形態(tài)特征與文獻描述的巴布亞新幾內亞群體[10]和福州群體[4]相符。益陽群體的形態(tài)測計值與巴布亞新幾內亞群體相比，除體環(huán)數(shù)(89～98)和唇盤至排泄孔后第一環(huán)之間的體環(huán)數(shù)(23～30)分別比巴布亞新幾內亞群體的(99～100)和(30～35)偏小外，其它測計值均與巴布亞新幾內亞群體相吻合。益陽群體的口針長、尾長、b值、c值和VL/VB值與福州群體完全相符，其它測計值雖然存在一定差異，但均有范圍重疊。同種線蟲不同群體間存在形態(tài)測量差異，這些差異可能是由群體地理分布、土壤環(huán)境條件和寄主不同所致。

由于擬鞘線蟲種類較多，種間形態(tài)學特征比較相似，僅依靠形態(tài)學特征難以進行準確鑒定，故需結合分子生物學方法對擬鞘線蟲做進一步鑒定。目前擬鞘線蟲的種類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析主要采用rDNA(ITS序列、18S序列和28S序列)和mtDNA(COI序列)的部分序列[2, 11]。本研究利用rDNA的ITS區(qū)序列和28S的D2/D3區(qū)序列對苧麻根際的擬鞘線蟲進行種類鑒定，結果表明，該擬鞘線蟲益陽群體的rDNA-ITS區(qū)和28S rDNA-D2/D3區(qū)序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的加德擬鞘線蟲相似性均為97%，系統(tǒng)發(fā)育分析顯示該線蟲群體與加德擬鞘線蟲的親緣關系最近。因此，分子生物學方法進一步證明了該線蟲群體為加德擬鞘線蟲。

加德擬鞘線蟲是Loos[12]于1949年在斯里蘭卡茶樹上首次發(fā)現(xiàn)，其后在美國、印度、巴布亞新幾內亞、斐濟、紐埃、薩摩亞、湯加等地均有報道，寄主包括茶樹、咖啡、山茶等一些木本植物[10, 13]。在我國，加德擬鞘線蟲于2013年在福建省福州地區(qū)首次被發(fā)現(xiàn)，主要寄生和危害龍眼、香蕉等果樹[4, 14]。苧麻屬于蕁麻科苧麻屬多年生草本植物，是加德擬鞘線蟲的新寄主，該線蟲對苧麻的危害程度還有待進一步研究。