基于HMGB1/TLR4信號(hào)通路評(píng)價(jià)五味子乙素對(duì)2型糖尿病腎病大鼠腎臟功能的保護(hù)作用

熊 剛 鄒 華 胡承蓮 吳 丹 鄧貴柳

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)為糖尿病中最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，也是引起終末期腎病最主要的誘導(dǎo)因素，調(diào)查發(fā)現(xiàn)約30%患者進(jìn)一步會(huì)惡化為糖尿病腎病階段[1]。DN發(fā)病早期主要表現(xiàn)為腎小球?yàn)V過(guò)能力增高及尿中出現(xiàn)微量白蛋白，如果未能得到及時(shí)治療會(huì)出現(xiàn)腎小球萎縮、基膜增厚及細(xì)胞外基質(zhì)堆積，進(jìn)一步引發(fā)慢性腎功能不全，直接影響患者的生存質(zhì)量[2]。倘若對(duì)DN疾病發(fā)展早期進(jìn)行及時(shí)干預(yù)，會(huì)改善尿中微量蛋白流出，防止患者進(jìn)入臨床蛋白尿期。一旦患者疾病惡化為臨床蛋白尿期，患者的腎臟功能將會(huì)受到急劇損傷，所以研究DN早期治療的方法具有重大臨床意義[3]。高遷移率族蛋白1(HMGB1)屬于一種核內(nèi)非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，可通過(guò)與胞膜上Toll樣受體4(TLR4)結(jié)合從而激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)，進(jìn)一步誘導(dǎo)炎性信號(hào)的活化，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)炎性反應(yīng)[4,5]。

五味子乙素(schisandrin B，SchB)是從五味子中提取分離得到的木質(zhì)素類天然活性化合物，表現(xiàn)出顯著的抗氧化、抗炎癥及抗細(xì)胞凋亡的作用，它可以通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)炎性通路活化達(dá)到對(duì)心臟、大腦、肝臟及腎臟等組織的保護(hù)作用[6～8]。目前，SchB對(duì)DN大鼠的保護(hù)作用及其對(duì)HMGB1/TLR4信號(hào)通路的相關(guān)作用不明確，本研究探討了SchB對(duì)DN大鼠腎臟功能及HMGB1/TLR4炎性通路活化的影響，以期為DN早期治療提供新的研究思路。

材料與方法

1.動(dòng)物及試劑：200～250g雄性SD大鼠40只(遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證SCXK2010-0005)，分籠飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中。五味子乙素(山東綠葉制藥，批號(hào)H2011051108，純度≥98%)，鏈脲佐菌素(美國(guó)Sigma公司)；HE染色試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)；HMGB1(貨號(hào)CZ-20170614)、TLR4(貨號(hào)ab0252411)、IL-1β(貨號(hào)ab1025855)、IL-6(貨號(hào)ab1102239)、TNF-α(貨號(hào)ab2252172)及β-actin(貨號(hào)ab2255027)單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

2.DN模型構(gòu)建及藥物治療：采用尾靜脈注射鏈脲佐菌素構(gòu)建DN模型，3天后檢測(cè)大鼠血糖濃度，其中血糖濃度≥16.65mmol/L的大鼠作為實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物給予低(15mg/kg)、高(30mg/kg)劑量SchB灌胃，1次/1天，連續(xù)4周。正常對(duì)照組及DN組大鼠給予同體積生理鹽水灌胃。

3.生化指標(biāo)檢測(cè)：大鼠灌胃4周后，收集各組大鼠24h尿液。采用適量的10%水合氯醛麻醉大鼠后，每只采取3ml，靜置于冰上2h后3000×g離心5min，吸去血清轉(zhuǎn)移至無(wú)菌Ep管內(nèi)。采用全自動(dòng)生化分析儀(西門(mén)子)測(cè)定各組大鼠ALT、Ucr、Scr、Cys-c及Ccr值。

4.HE染色實(shí)驗(yàn)：采血結(jié)束后開(kāi)腹收集大鼠腎臟組織，用生理鹽水反復(fù)沖洗至顏色變白，將左側(cè)腎臟組織修飾為5mm×5mm×5mm的組織塊，放入4%甲醛中固定，用于HE染色。右側(cè)腎臟組織立即放入-80 ℃冰箱用于Western blot法實(shí)驗(yàn)。

5.Western blot法檢測(cè)：稱取腎臟組織10mg，在冰上用碾磨器攪碎后4℃、13000×g離心15min，吸取蛋白上清至新Ep管中，采用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，加入適量上樣緩沖液混勻，100℃煮沸7min。用12%的SDS-PAGE凝膠塊電泳分離蛋白，完成后轉(zhuǎn)膜。切割不同分子量目的蛋白至對(duì)應(yīng)一抗溶液中(稀釋比均為1∶3000)，4℃震蕩過(guò)夜，采用HRP標(biāo)記的二抗(稀釋比1∶1000)37℃孵育1h，TBST洗膜3次后加入ECL顯影液，采用X光膠片曝光。

結(jié) 果

1.五味子乙素對(duì)DN大鼠腎臟功能指標(biāo)的影響：五味子乙素治療對(duì)DN大鼠腎功能指標(biāo)影響結(jié)果如表1所示，提示DN組Scr、Cys-c及ALT水平相對(duì)于正常對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，而Ucr、Ccr水平則顯著降低(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)大鼠DN模型構(gòu)建成功。但是經(jīng)過(guò)低、高劑量五味子乙素治療后，大鼠Scr、Cys-c及ALT水平相對(duì)于DN組顯著降低(P<0.05)，而Ucr、Ccr水平明顯升高(P<0.05)。

表1 各組大鼠Scr、Ucr、Ccr及Cys-c比較

2.五味子乙素對(duì)DN大鼠腎臟組織形態(tài)的影響：大鼠腎臟組織形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組腎臟組織結(jié)構(gòu)正常，DN組腎小球有一定程度萎縮，組織結(jié)構(gòu)排列不均勻，并且有腫脹，脫落現(xiàn)象，還存在空泡樣變性，鮑曼囊腔擴(kuò)；而經(jīng)過(guò)高劑量五味子乙素治療后，可改善上述不良形態(tài),詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組間大鼠腎臟組織形態(tài)比較(HE染色，×200)

3.五味子乙素對(duì)DN大鼠腎臟組織HMGB1/TLR4通路的影響：五味子乙素治療對(duì)DN大鼠腎臟組織HMGB1/TLR4通路影響結(jié)果如圖2、表2所示，提示DN組HMGB1、TLR4蛋白表達(dá)水平相對(duì)于正常對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，而經(jīng)過(guò)低、高劑量五味子乙素治療后，大鼠腎臟組織HMGB1、TLR4蛋白表達(dá)水平相對(duì)于DN組顯著降低(P<0.05)。

圖2 各組間大鼠腎臟組織HMGB1、TLR4蛋白表達(dá)比較

表2 HMGB1、TLR4蛋白表達(dá)水平

4.五味子乙素對(duì)DN大鼠腎臟組織炎性因子的影響：如圖3、表3所示，DN組IL-1β、IL-6及TNF-α蛋白表達(dá)水平相對(duì)于正常對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，而經(jīng)過(guò)低、高劑量五味子乙素治療后，大鼠腎臟組織IL-1β、IL-6及TNF-α蛋白表達(dá)水平相對(duì)于DN組顯著降低(P<0.05)。

圖3 各組間大鼠腎臟組織炎性蛋白表達(dá)比較

表3 IL-1β、IL-6及TNF-α蛋白表達(dá)水平

討 論

糖尿病屬于一種常見(jiàn)的內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病，然而DN為糖尿病較為常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，最后也許惡化為慢性腎功能不全及終末期腎衰竭，會(huì)給患者及家庭帶來(lái)極大的影響[9]。DN主要為血糖急劇升高外，還常伴隨著蛋白質(zhì)及脂肪等代謝異常及腎臟組織病變[10]。五味子常用于滋補(bǔ)的中藥，性味溫和，對(duì)人體心臟、肝臟、脾臟、肺及腎臟起著平衡作用，還屬于補(bǔ)益類及鎮(zhèn)靜類中藥，然而對(duì)其成分提取發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素的藥理活性最強(qiáng)，其中SchB是最主要的活性化合物之一。已有研究發(fā)現(xiàn)SchB能通過(guò)抑制TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起到抗腎纖維化的作用[11]。原麗欣[12]研究發(fā)現(xiàn)SchB可通過(guò)增強(qiáng)SOD及GSH-Px等抗氧化酶活性，改善活性氧(ROS)所致腎組織的氧化損傷。但是SchB對(duì)糖尿病所致腎病的保護(hù)作用尚未見(jiàn)相關(guān)研究。本研究采用尾靜脈注射鏈脲佐菌素構(gòu)建DN模型，發(fā)現(xiàn)大鼠Scr、Cys-c及ALT水平顯著升高，而Ucr、Ccr水平顯著降低，說(shuō)明DN組大鼠腎臟功能受到嚴(yán)重?fù)p傷。通過(guò)給予低、高劑量SchB治療4周后，上述生物學(xué)指標(biāo)均得到明顯改善，并且腎臟組織形態(tài)也得到部分改善，由此提示SchB對(duì)糖尿病所致腎病大鼠的腎臟功能具有改善作用。

在DN發(fā)病過(guò)程中，疾病早期腎小球及間質(zhì)會(huì)出現(xiàn)巨噬細(xì)胞及T細(xì)胞浸潤(rùn)，白細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β、IL-6及TNF-α等促炎性因子，后者進(jìn)一步誘發(fā)腎臟細(xì)胞產(chǎn)生多種趨化因子，引發(fā)新一輪的炎性反應(yīng)[13]。HMGB1能與細(xì)胞膜上TLR2及TLR4受體相互作用，活化細(xì)胞內(nèi)炎性通路，誘發(fā)炎性因子的大量產(chǎn)生。早期發(fā)現(xiàn)糖尿病患者TLR4表達(dá)量顯著增高，能誘導(dǎo)下游分子NF-κB轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，促使炎性基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步導(dǎo)致腎臟受損[14]。糖尿病患者常出現(xiàn)肥胖、胰島素抵抗及氧化應(yīng)激增強(qiáng)等病癥，還發(fā)現(xiàn)存在熱休克蛋白60及游離脂肪酸的含量升高，從而活化TLR4/NF-κB炎性轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，誘導(dǎo)大量細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，導(dǎo)致炎性損傷[15～17]。由于TLR4介導(dǎo)下胞內(nèi)各信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相互作用，共同加劇ND疾病的發(fā)生、發(fā)展。

本研究中低、高劑量SchB組與DN組大鼠比較，HMGB1及TLR4蛋白表達(dá)量顯著降低。前期研究發(fā)現(xiàn)，SchB可通過(guò)抑制TLR4/NF-κB/MyD88信號(hào)通路活化進(jìn)而降低神經(jīng)炎性反應(yīng)及改善膿毒癥，說(shuō)明SchB可以下調(diào)TLR4蛋白表達(dá)[18]。然而SchB對(duì)HMGB1蛋白表達(dá)的報(bào)道較少，本文結(jié)果提示SchB同樣可以降低HMGB1蛋白表達(dá)，進(jìn)一步抑制其下游基因TLR4的活化，但是SchB是否可以直接作用于HMGB1蛋白尚需進(jìn)一步研究。研究還發(fā)現(xiàn)SchB可誘導(dǎo)炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-α的表達(dá)量的降低，HE染色發(fā)現(xiàn)SchB對(duì)腎臟組織具有保護(hù)作用，提示SchB可能通過(guò)抑制腎臟HMGB1及TLR4的表達(dá)進(jìn)而抑制炎性通路的活化，降低細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，發(fā)揮對(duì)DN大鼠腎臟的治療作用，然而SchB對(duì)炎性轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)通路的影響機(jī)制還有待于深入探討。