乳腺癌腫瘤組織和血漿中miR-21、miR-210的含量及臨床意義

陸蕓瑤 王 卉 喻 垚 李光新 吳立翔 郭變琴

乳腺癌是起源于乳腺組織的一種復雜的異質(zhì)性疾病，病死率居全球癌癥病死率的第5位[1]。現(xiàn)臨床上常用乳腺鉬靶X線攝影篩查乳腺癌，但頻繁的篩查顯著提高了疾病假陽性率(>20%)，增加了受檢女性的心理負擔并且其對健康女性的長期影響還未明確[2]。臨床上根據(jù)癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)的含量等輔助診斷乳腺癌，但其敏感度低、特異性差，不能有效篩查早期癌癥及原位癌，而且部分檢測結果相同的乳腺癌患者其臨床表現(xiàn)差異較大[3]。所以有必要研究更加敏感的診療因子，用以乳腺癌的早期診斷及高患病風險人群的識別。

microRNA(miRNA)是一類18～22個核苷酸組成的非編碼RNA,其表達存在組織特異性、穩(wěn)定性高、檢測可重復性強。多個研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者組織及血漿中存在特異表達的miRNA,提示miRNA可以作為一種新的腫瘤診療標志物[4]。

miR-21和miR-210在胰腺癌、前列腺癌、胃癌、肝癌、腸癌和卵巢癌等多種癌癥中高表達,參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等多個過程[5]。miR-21和miR-210在乳腺癌中的研究相對較少，對乳腺癌的診斷價值還未有明確定論。本研究通過實時熒光定量PCR方法檢測miR-21和miR-210在乳腺癌組織和血漿中的含量，同時應用ROC曲線評價其在乳腺癌中的診斷價值以及通過Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站分析其與患者預后的關系,旨在探尋一種用于乳腺癌早期診斷及預后評價指標。

材料與方法

1.材料：收集2016～2017年在重慶大學附屬腫瘤醫(yī)院病理學確診的乳腺癌患者腫瘤組織及血漿標本。其中，乳腺癌患者腫瘤組織標本31例，患者平均年齡52.84±8.57歲；另取癌旁組織36例作為正常對照組，平均年齡40.89±12.27歲。乳腺癌血漿樣本25例，平均年齡47.36±11.72歲；另隨機選取筆者醫(yī)院體檢健康女性血漿樣本21例作為正常對照，平均年齡41.57±9.80歲?；颊呋厩闆r詳見表1。本研究獲得重慶大學附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準，且所有患者均簽署知情同意書。

表1 患者基本情況

2.主要試劑與儀器設備：(1)主要試劑：miRcute miRNA提取分離試劑盒、血清/血漿miRNA提取分離試劑盒、石蠟包埋組織切片miRNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，miRNA反轉錄試劑盒、miR-21、miR-210及內(nèi)參U6的特異性莖環(huán)引物購自美國Genecopoeia公司，SYBR@PremixExTaq試劑盒購自寶生物工程有限公司。(2)儀器設備：CFX-Connect熒光定量PCR儀、T100 Thermal Cycler 梯度PCR儀(美國Bio-Rad公司)，NANODROP 1000核酸濃度測定儀、FRESCO17高速冷凍離心機(美國Thermo公司)。

3.研究方法：(1)miRNA提?。喝⌒迈r冷凍的乳腺組織20～25mg，液氮中進行研磨；轉移石蠟切片1～8片至離心管中；取收集的抗凝血，離心后獲得上層血漿。分別參照相應miRNA提取試劑盒說明書提取miRNA，檢測miRNA的A260/A280比值及濃度。(2)實時熒光定量PCR：取100ng RNA，參照miRNA反轉錄試劑盒進行反轉錄。使用SYBR@Premix Ex Taq試劑盒檢測miR-21、miR-210的含量：SYBR@Premix Ex Taq 12.5μl(2×)，qPCR Forward Primer 0.5μl，qPCR Forward Primer 0.5μl，cDNA(稀釋5倍) 2μl，Nuclease-free water 9.5μl。反應條件: 95℃ 10min，95℃ 10s，60℃ 20s，72℃ 10s，45個循環(huán)。

結 果

1.乳腺癌患者腫瘤組織中miR-21、miR-210含量：采用熒光定量PCR檢測miR-21、miR-210在31例乳腺癌腫瘤組織和36例癌旁正常組織(對照組)中的含量，結果顯示，與癌旁正常組織比較,miR-21在乳腺癌腫瘤組織中含量顯著升高 (P=0.011，圖1A)；而miR-210的含量比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.193，圖1B)。

圖1 乳腺癌患者腫瘤組織中miRNA的含量

2.乳腺癌患者血漿中miR-21、miR-210含量：采用熒光定量PCR檢測miR-21、miR-210在25例乳腺癌患者血漿和21例健康者血漿(對照組)的含量。結果顯示，與對照組比較,miR-21、miR-210在乳腺癌患者血漿中的含量差異無統(tǒng)計學意義(P=0.874，P=0.457，圖2)。

圖2 乳腺癌患者血漿中miRNA的含量

3.miR-21診斷乳腺癌的ROC曲線：繪制ROC曲線, 評價miR-21在乳腺癌中的診斷價值, ROC曲線下面積趨近于1, 該指標對疾病的預測價值越高。miR-21的AUC=0.695(圖3), miR-21在乳腺癌的診斷中具有一定的作用。

圖3 組織miRNA-21輔助診斷乳腺癌的ROC曲線

4.miR-21的含量與乳腺癌患者生存曲線分析：通過Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站分析miR-21與乳腺癌患者預后的關系。結果顯示，miR-21高含量組生存時間明顯低于miR-21低含量組，經(jīng)log-rank檢驗，兩組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.019)。

圖4 乳腺癌患者miR-21含量-生存曲線

討 論

乳腺癌是全球女性癌癥患者中最常見的癌癥，每年全球的新增病例超過100萬例。乳腺癌導致的女性病死率居癌癥相關病死率的第2位[6,7]。所以研究更加敏感的乳腺癌早期診斷腫瘤標志物顯得尤為重要。miRNA可以作為診斷標志物的基礎是miRNA在患病組織及血液中存在特異的穩(wěn)定的表達。

miRNA-21在多個實體瘤(前列腺癌、直腸癌、肺癌等)中的表達均上調(diào)，參與多個腫瘤抑制基因(PTEN、PDCD4、p53等)的調(diào)控，與腫瘤細胞的生長、入侵和轉移等有關[2]。在乳腺癌中，miR-21參與癌細胞的增殖與轉移[8]。有研究報道m(xù)iR-21在乳腺癌患者組織中表達上調(diào)， miR-21 的含量和激素水平及疾病分期、淋巴結轉移、遠端轉移、ROC曲線等相關[2]。另有研究報道血漿中miR-21的含量和激素水平及疾病分期無關[9]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者腫瘤組織中miR-21的含量顯著高于對照組，而血漿中miR-21的含量與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。筆者實驗結果表明組織中miR-21可作為乳腺癌診斷腫瘤標志物, 后續(xù)仍需大量的標本進行驗證。為了進一步研究miR-21對乳腺癌的診斷價值，筆者進行了ROC曲線分析，AUC作為評價指標，AUC越大說明診斷效果更好。ROC曲線下面積為0.695，表明組織中miR-21的含量可作為乳腺癌診斷有效指標。另外，筆者還使用Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站分析了miR-21的生存曲線，發(fā)現(xiàn)miR-21高含量組生存時間明顯少于miR-21低含量組，說明miR-21含量的高低和乳腺癌預后相關。

有研究表明，miR-210在乳腺癌患者血漿中含量升高,筆者實驗結果表明乳腺癌腫瘤組織、血漿中miR-210的含量與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義, miR-210在腫瘤組織與血漿結果相一致,均未升高[5]。與文獻報道不一致的原因可能為各實驗室標本采集及實驗技術流程的不同造成結果的差異, 因為不同的標本會影響miRNA的表達，如標本的種族差異、標本量、對照組的選擇等, 對于血漿標本而言，抗凝劑的不同、新鮮血液標本還是凍存血液標本、標本是否存在肉眼不可見的溶血、脂血等也會影響miRNA的表達。不同的實驗技術同樣會影響miRNA的表達，如miRNA提取方式、內(nèi)參的選擇、檢測方法的不同, 離心的轉速、RNA濃度的檢測這些都會影響miRNA的表達[10，11]。

此外, 由于腫瘤患者血漿中的miRNA主要來源于腫瘤細胞的凋亡，應激、炎癥及遷移等導致的腫瘤細胞損傷后miRNA的釋放, 不同病理狀態(tài)下，miRNA被選擇性地釋放到血漿中, 因此標本采集的時間點對于結果的影響非常大[12，13]。另有研究報道，miRNA不僅可作為癌癥的血漿腫瘤標志物，也可以作為其他疾病的標志物 (如miR-21 、miR-210在腸炎、潰瘍、心血管系統(tǒng)疾病、肝臟疾病、糖尿病等疾病中存在差異表達), 收集單純患有乳腺癌的標本難度極大[14]。以往的研究包括筆者的研究中收集的患者大多患有一些心血管系統(tǒng)、糖尿病等疾病, 這些不同的疾病狀態(tài)可能會影響miR-21、miR-210在血漿中的表達。miRNA的表達也極易受到患者飲食習慣、生活方式等的影響，即使一個小小的靜脈穿刺也有可能影響其表達[11，15]。

總之, 由于血漿中miRNA的含量受多因素影響， 因此選取血漿miRNA作為腫瘤標志物還需要制定統(tǒng)一的標準實驗流程, 如:樣本收集、處理、檢測方法的選擇、參考區(qū)間的確定等。多個miRNA聯(lián)合檢測比單個miRNA檢測更敏感，選擇哪些miRNA作為生物學標志物需要開展大量實驗研究進行驗證。