不同方法學(xué)檢測(cè)急性髓系白血病MPO陽(yáng)性率的比較及意義

鄭 瑞 章 鴦 陳葆國(guó) 沈芝穎 林愛(ài)芬

白血病的精準(zhǔn)診斷需要多學(xué)科(形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué))的綜合診斷。目前骨髓細(xì)胞涂片形態(tài)學(xué)仍是基礎(chǔ)，形態(tài)學(xué)對(duì)急性髓系白血病(AML)的分型主要依據(jù)1986年的FAB(French-American-Britain)的分型標(biāo)準(zhǔn)。組織化學(xué)染色輔助用于白血病的形態(tài)學(xué)分型，其中髓過(guò)氧化物酶(MPO)染色是鑒別髓系白血病的關(guān)鍵指標(biāo)。實(shí)際工作中，筆者發(fā)現(xiàn)部分AML患者骨髓病理切片、細(xì)胞涂片及流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)白血病細(xì)胞胞內(nèi)MPO活性的結(jié)果并不一致，本研究通過(guò)對(duì)這3種方法檢測(cè)AML胞內(nèi)MPO的結(jié)果進(jìn)行比較，探討三者之間的優(yōu)缺點(diǎn)及臨床意義。

資料與方法

1.一般資料： 對(duì)筆者醫(yī)院2012年5月～2016年3月初診AML，且均進(jìn)行骨髓活檢、免疫學(xué)分型及骨髓形態(tài)學(xué)檢查的患者，共計(jì)90例，其中男性58例，女性37例，患者年齡1～93歲，中位年齡60.5歲，按FAB分型，詳見(jiàn)表1。

2.檢測(cè)方法： (1)骨髓活檢標(biāo)本MPO染色：①Bouin氏固定液固定過(guò)夜；②放入EDTA脫鈣液脫鈣4～5h；③流水沖洗15min，投入脫水機(jī)，常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋切片3μm；④MPO染色：72℃烤片1h，二甲苯脫蠟2缸(10分鐘/每缸)，梯度乙醇脫水(梯度乙醇100%、95%、75%，2分鐘/每次)，PBS洗5次，高壓修復(fù)，PBS洗5次，3%雙氧水室溫孵育10min，PBS洗5次，加兔抗人MPO多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)37℃ 1h，PBS洗5次，二抗37℃ 20min、三抗各10min，DAB顯色5～10min，蘇木精復(fù)染2min，自來(lái)水沖洗，鹽酸酒精分化，逐級(jí)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。中性粒細(xì)胞作內(nèi)對(duì)照或陽(yáng)性標(biāo)本做陽(yáng)性對(duì)照，用PBS做陰性對(duì)照，低倍鏡或高倍鏡判斷，MPO+或MPO少量+均按陽(yáng)性統(tǒng)計(jì)。(2)骨髓涂片MPO染色 ：采用聯(lián)苯胺法染色，方法按試劑盒(上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行：新鮮骨髓涂片滴加Ι液(含聯(lián)苯胺等)數(shù)滴覆蓋血膜，室溫放置1min，滴加Ⅱ液(含過(guò)氧化氫)數(shù)滴，混勻后室溫放置5min,流水沖洗，滴加95%乙醇脫色，流水沖洗后瑞士-吉姆薩復(fù)染。陽(yáng)性顆粒呈棕黃或藍(lán)黑色，顆粒陽(yáng)性的原始細(xì)胞(包括幼稚單核細(xì)胞)>3%為MPO表達(dá)陽(yáng)性。(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胞內(nèi)MPO ：抽取骨髓液1.5ml，枸櫞酸鈉抗凝，取2支試管，兩管均加入10μl CD45-PerCP-Cy5.5單抗與50μl EDTA抗凝骨髓液[(1～2)×106個(gè)細(xì)胞]組合，避光15min。加溶血素2ml避光15min。300×g離心10min ，去上清，加2ml PBS洗一次，棄上清，每管加入100μl固定液(MEDIUM A)(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)，室溫孵育15min，加入2ml PBS洗1次，棄上清，每管加入100μl破膜劑(MEDIUM B)(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)，第1管加入IgG1-FITC及IgG1-APC同型抗體各10μl，第2管加MPO-FITC單抗(美國(guó)BD公司)10μl及CD3-APC單抗5μl，室溫孵育30min，加入2ml PBS洗1次，棄上清，每管加1%多聚甲醛0.5ml，BD FACS cantoⅡ流式細(xì)胞儀獲取，數(shù)據(jù)用FACS Diva軟件分析，陽(yáng)性MPO表達(dá)的原始細(xì)胞(包括幼稚單核細(xì)胞)>10%為MPO表達(dá)陽(yáng)性。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 ：所有數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料多組之間的比較采用χ2檢驗(yàn)，組間比較采用Bonferroni方法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.AML患者M(jìn)PO總體表達(dá)分析：AML患者共90例，MPO表達(dá)陰性僅見(jiàn)4例，3種方法聯(lián)合檢測(cè)MPO表達(dá)陽(yáng)性率為95.5%。除AML-M7亞型均呈MPO陰性表達(dá)外，MPO陰性患者僅出現(xiàn)在AML-M5亞型(表1)。

表1 AML患者FAB分型及MPO陽(yáng)性率

2.3種方法檢測(cè)AML患者M(jìn)PO陽(yáng)性率的比較：90例AML患者骨髓活檢組織、骨髓涂片及骨髓液標(biāo)本MPO陽(yáng)性率分別是66.7%(60/90)、93.3%(84/90)及87.8%(79/90)(表1)，陽(yáng)性率明顯不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=24.782,P=0.000)。其中，免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)MPO陽(yáng)性率顯著低于骨髓涂片細(xì)胞化學(xué)法和流式細(xì)胞學(xué)方法(P<0.05)，而細(xì)胞化學(xué)法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MPO陽(yáng)性率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3.AML-M5患者M(jìn)PO表達(dá)：除M7(急性巨核細(xì)胞白血病外)，MPO共陰性的標(biāo)本只見(jiàn)于M5患者中，因此，為比較3種方法對(duì)原始幼稚單核細(xì)胞MPO表達(dá)的敏感度，對(duì)27例M5患者的MPO表達(dá)分析，免疫組化陽(yáng)性率為37%(10/27)明顯低于細(xì)胞化學(xué)法(88.9%，24/27)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，免疫組化法低于流式細(xì)胞學(xué)方法(63.0%，17/27)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MPO結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。以其中1例M5b患者為例，組化顯示原始及幼稚單核細(xì)胞MPO(-)，但骨髓涂片原始及幼稚單核細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)明顯MPO陽(yáng)性顆粒，免疫學(xué)分型顯示MPO陽(yáng)性率占14.2%(圖1)。

圖1 1例AML-M5b患者酶免疫組織化學(xué)、細(xì)胞化學(xué)及流式細(xì)胞學(xué)MPO檢測(cè)結(jié)果比較

討 論

多參數(shù)流式細(xì)胞學(xué)的應(yīng)用使白血病的免疫學(xué)分型更為精確，但MPO仍然是FAB及WHO分型鑒定AML或者急性非淋巴細(xì)胞白血病(ANLL)關(guān)鍵的參考指標(biāo)[1]。流式細(xì)胞學(xué)、免疫組織化學(xué)及細(xì)胞化學(xué)3種方法，任何一種能檢測(cè)到白血病細(xì)胞MPO表達(dá)陽(yáng)性的結(jié)果，都可以認(rèn)為其具髓系分化特征[2]。上述3種檢測(cè)方法相互補(bǔ)充，本研究對(duì)90例AML患者的MPO進(jìn)行檢測(cè)，均為陰性結(jié)果的標(biāo)本僅為4例，其中包含1例M7患者，可見(jiàn)通過(guò)多種方法對(duì)急性白血病骨髓標(biāo)本MPO的檢測(cè)可以鑒定絕大多數(shù)急性非淋巴細(xì)胞白血病，然而在AML的實(shí)驗(yàn)室診斷實(shí)際過(guò)程中，上述3種檢測(cè)時(shí)間并不同步，MPO檢測(cè)結(jié)果并非完全一致。因此本研究回顧分析了筆者醫(yī)院部分初診AML患者M(jìn)PO表達(dá)情況，對(duì)上述3種檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較和分析，以利于臨床醫(yī)生對(duì)檢測(cè)報(bào)告更好的解讀。

本研究數(shù)據(jù)表明3種方法對(duì)MPO檢測(cè)，結(jié)果明顯不一致，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，活檢組織MPO陽(yáng)性率最低，顯著少于細(xì)胞化學(xué)及流式細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)MPO的陽(yáng)性率(P均<0.05)，細(xì)胞化學(xué)與流式細(xì)胞學(xué)兩者檢測(cè)MPO陽(yáng)性率最接近(P>0.05)。從FAB分型中各類(lèi)AML細(xì)胞MPO陽(yáng)性率看，除M0和M7之外，AML-M5患者的MPO陽(yáng)性率各種方法檢測(cè)均最低，各組間差異亦明顯，而以組織化學(xué)方法檢測(cè)MPO陽(yáng)性率最低，與細(xì)胞化學(xué)之間的差異最明顯。相對(duì)而言，細(xì)胞化學(xué)法或流式細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)AML患者M(jìn)PO敏感度更高。對(duì)于多克隆抗體檢測(cè)活檢組織白血病細(xì)胞MPO敏感度低于細(xì)胞化學(xué)法和流式細(xì)胞學(xué)方法的原因，筆者認(rèn)為，可能在于原始及幼稚單核細(xì)胞本身低表達(dá)MPO，病理免疫組化涂片對(duì)弱或極弱表達(dá)的MPO不易分辨，而油鏡下對(duì)骨髓涂片MPO陽(yáng)性顆粒較少的細(xì)胞更容易辨認(rèn)，流式細(xì)胞術(shù)MPO單克隆抗體檢測(cè)通過(guò)設(shè)門(mén)分析有能夠排除背景細(xì)胞干擾的優(yōu)勢(shì)。三者檢測(cè)原理的區(qū)別在于聯(lián)苯胺法是對(duì)MPO酶活性的鑒定，而多克隆抗體方法對(duì)骨髓活檢組織切片或單克隆抗體流式細(xì)胞術(shù)等免疫學(xué)方法檢測(cè)胞內(nèi)MPO，只能反映MPO是否存在，不能反映酶的活性。這樣，理論上會(huì)存在對(duì)部分患者用3種方法檢測(cè)MPO結(jié)果不一致的現(xiàn)象[3]。

本研究AML-M0患者共2例，雖然活檢組織及細(xì)胞涂片MPO陰性反應(yīng)，但流式細(xì)胞術(shù)顯示2例均表達(dá)MPO蛋白，足見(jiàn)流式細(xì)胞術(shù)在白血病分型中的優(yōu)勢(shì)，這或許因?yàn)楸狙芯?例M0患者僅存在MPO前體蛋白，而無(wú)酶活性有關(guān)[3]。除外電子顯微鏡檢測(cè)技術(shù)，免疫學(xué)方法較細(xì)胞化學(xué)方法更敏感[4]。除AML-M0外，本研究細(xì)胞化學(xué)染色法與流式細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)MPO相比較，結(jié)果較一致，與文獻(xiàn)報(bào)告結(jié)果相似[5，6]。此外，本研究?jī)衫鼳ML-M5a患者細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)MPO陽(yáng)性而流式細(xì)胞術(shù)未檢出，或許和兩者陽(yáng)性率判斷標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)，大樣本資料更有利于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

總之，本研究顯示不同的MPO檢測(cè)方法，AML患者M(jìn)PO陽(yáng)性檢出率不盡相同，流式細(xì)胞術(shù)對(duì)AML-M0的診斷有不可替代的優(yōu)勢(shì)，細(xì)胞化學(xué)染色對(duì)AML-M5患者M(jìn)PO的敏感度優(yōu)于流式細(xì)胞術(shù)，三者結(jié)合可以顯著提高AML患者M(jìn)PO的檢出率，比單獨(dú)一種方法更有助于急性白血病的準(zhǔn)確分型。