等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) 在食源性致病菌檢測(cè)中的研究進(jìn)展

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(1.內(nèi)江職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)業(yè)技術(shù)系,四川內(nèi)江 641000; 2.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,陜西西安 710000)

2014年,國務(wù)院食品安全委員會(huì)提出“食品安全示范城市”建設(shè)工作,要求食品抽檢量較原來提高50%左右,給當(dāng)下食品檢測(cè)技術(shù)、人員、設(shè)備帶來了巨大考驗(yàn)。目前食品中致病菌檢測(cè)國標(biāo)方法-生化培養(yǎng)法,雖然較準(zhǔn)確,但耗時(shí)長(zhǎng)。如沙門氏菌檢測(cè)周期一般為5～7 d,相對(duì)流程較為簡(jiǎn)單的金黃色葡萄球菌的檢測(cè)也需要3～5 d,無法適應(yīng)當(dāng)下食品安全檢測(cè)的大環(huán)境。因此,探尋高效、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法成為了學(xué)者們當(dāng)下的一個(gè)重要研究方向。

分子檢測(cè)技術(shù)是致病菌檢測(cè)的一種重要手段,其精準(zhǔn)度高、檢測(cè)速度快。80年代問世的PCR技術(shù),在近30年間已被廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的檢測(cè)中。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的出現(xiàn),使得擴(kuò)增反應(yīng)不再依賴于精密的金屬浴,大大降低了反應(yīng)時(shí)間,提高了反應(yīng)效率。

目前常用于食源性致病菌檢測(cè)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)包括環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)(Nuclear acid sequence-based amplification,NASBA)、鏈置換擴(kuò)增技術(shù)(strand displacement amplification,SDA)、缺口依賴酶鏈置換擴(kuò)增技術(shù)(nickase-dependent amplification NDA)、網(wǎng)狀分支擴(kuò)增技術(shù)(ramification amplification method,RAM)、依賴解旋酶擴(kuò)增技術(shù)(Helicase-dependent isothermal amplification,HDA)、重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)等,本文對(duì)上述各種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的原理、應(yīng)用現(xiàn)狀及其優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行綜述。

1 環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)

LAMP是2000年問世的一項(xiàng)等溫?cái)U(kuò)增新技術(shù)[1],其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因設(shè)計(jì)4個(gè)特異引物,利用鏈置換DNA聚合酶可在恒溫60～65 ℃,60 min內(nèi)完成擴(kuò)增,靈敏度高,且對(duì)設(shè)備要求低。該技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品中金黃色葡萄球菌[2-4]、單增李斯特菌[5]、沙門氏菌[6-7]、銅綠假單孢菌[8]等的檢測(cè)。依靠RT-LAMP,可同時(shí)對(duì)病毒進(jìn)行檢測(cè)[9],結(jié)合熒光探針,可同時(shí)進(jìn)行定量分析[10]。由于LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物電泳呈階梯狀,結(jié)果不易判斷,限制了基礎(chǔ)LAMP檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用,但某種程度上也促進(jìn)了學(xué)者們對(duì)LAMP可視化配套檢測(cè)手段的研究。如在DNA延伸合成時(shí),從脫氧核苷三磷酸基質(zhì)(dNTPs)中析出的焦磷酸離子與反應(yīng)溶液中的鎂離子結(jié)合,會(huì)產(chǎn)生一種焦磷酸鎂衍生物的白色沉淀,利用這一特點(diǎn)用肉眼即可判斷擴(kuò)增與否,然而,該法雖然實(shí)現(xiàn)了可視化檢測(cè),但其結(jié)果不易判斷。隨后,有學(xué)者在反應(yīng)液中加入熒光染料,再將擴(kuò)增產(chǎn)物置于熒光下,可見陽性產(chǎn)物為綠色,陰性產(chǎn)物為橙色,提高了判斷的精度,但卻要依賴于熒光透色儀[11]。對(duì)此,又有學(xué)者提出,在體系中加入MgSO4、MnCl2及Ca2+使陽性反應(yīng)結(jié)果直接出現(xiàn)肉眼可見的綠色鈣錳復(fù)合物,判斷結(jié)果更為方便精準(zhǔn)[12];此外,Gong等[13]在反應(yīng)液中加入羥基萘酚藍(lán)(HNB),使得陽性結(jié)果為深藍(lán)色,而陰性結(jié)果為綠色,提高了判斷的精度,且檢測(cè)限能達(dá)到100 copies/μL;唐毓祎[14]利用LAMP與免疫金技術(shù)相結(jié)合,先將LAMP的引物進(jìn)行巰基化修飾后,再利用一種特殊的加金方式,即利用金溶液來稀釋引物,讓巰基修飾的引物與金先進(jìn)行自我組裝,擴(kuò)增后使得陽性反應(yīng)為紅色,陰性為藍(lán)色。

總體而言,LAMP是一種實(shí)用性強(qiáng)且高效的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),然而也有其劣勢(shì),如加入環(huán)引物后,易出現(xiàn)假陽性,雖然可通過降低環(huán)引物的濃度降低假陽性的出現(xiàn)效率[16];卻無法避免LAMP引物設(shè)計(jì)要求高,難度大的缺陷,建立的方法需經(jīng)過大量的工作進(jìn)行引物驗(yàn)證;此外,LAMP只能擴(kuò)增300 bp左右的產(chǎn)物,不適合擴(kuò)增較長(zhǎng)片段;且其產(chǎn)物不均一,不易回收;反應(yīng)過程中開蓋易污染。盡管有著上述不足之處,但LAMP依然備受學(xué)者們青睞,可見其獨(dú)到之處,隨著技術(shù)的發(fā)展,其不足也將會(huì)慢慢規(guī)避。

2 依賴核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)

NASBA是一種依賴于T7RNA聚合酶、RNAseH、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶相互作用完成擴(kuò)增的方法[17],可在42 ℃,2 h內(nèi),將RNA擴(kuò)增109～1012倍,具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn),其擴(kuò)增產(chǎn)物為RNA。該方法的原理為65 ℃ RNA預(yù)熱后恢復(fù)42 ℃時(shí),引物P1(5′端含T7RNA酶識(shí)別的啟動(dòng)子)與RNA模板退火結(jié)合后被AMV催化逆轉(zhuǎn)錄生成DAN-RNA雜交鏈,RNAseH水解雜交鏈上的RNA,引物P2再與剩余的DNA鏈退火結(jié)合,AMV再次催化生成雙鏈DNA。此雙鏈DNA帶有一個(gè)T7RNA酶識(shí)別的啟動(dòng)子,被T7RNA識(shí)別并催化其轉(zhuǎn)錄,生成更多單鏈模板RNA,再次進(jìn)入循環(huán)。

自NASBA問世以來,大量學(xué)者將其應(yīng)用到致病菌的檢測(cè)中,Fykse等[18]和Borst等[19]利用NASBA方法檢測(cè)水樣中霍亂弧菌和食品中的念珠菌,以瓊脂糖凝膠電泳作為檢測(cè)手段,分別經(jīng)過3和2 h的擴(kuò)增反應(yīng),其檢測(cè)限可達(dá)到50 cfu/mL和60 cfu/mL。然而,NASBA產(chǎn)物主要為單鏈RNA,電泳時(shí)非常容易降解,因此,易出現(xiàn)假陰性,這限制了基礎(chǔ)NASBA方法的推廣。

正因NASBA產(chǎn)物主要為單鏈RNA,這為探針檢測(cè)提供了便利[20],學(xué)者們建立了大量NASBA-探針法的致病菌檢測(cè)方法。雷質(zhì)文等[21]和倪鑫等[22]分別在P2引物5′端標(biāo)記生物素,在探針3′端標(biāo)記FITC,利用商品化的試紙條進(jìn)行檢測(cè),建立可視化分析方法,用以檢測(cè)食品中的沙門氏菌和副溶血性弧菌污染,其檢測(cè)限分別為710、510 cfu/mL,且均無交叉污染。王立朋等[23]根據(jù)曲霉菌18S rRNA保守序列區(qū)設(shè)計(jì)引物,建立NASBA-熒光探針法,定量分析食品中曲霉菌污染。杜麗等[24]將NASBA與ELISA結(jié)合,首先用鏈酶親和素包被微孔板,引物用地高辛標(biāo)記,探針用生物素標(biāo)記,再加入堿性磷酸酶標(biāo)記的地高辛抗體顯色,即鏈酶親和素-生物素標(biāo)記探針-地高辛標(biāo)記的產(chǎn)物-堿性磷酸酶標(biāo)記的地高辛抗體,檢測(cè)曲霉菌感染,結(jié)果表明,靈敏度可達(dá)到1 cfu/mL,其結(jié)果可通過顏色進(jìn)行可視化分析,又可根據(jù)OD值用于定量分析。該法雖然檢測(cè)精準(zhǔn),然而檢測(cè)成本高,且操作較為繁瑣。同時(shí),杜麗團(tuán)隊(duì)[25]還利用巰基化的探針,再將納米金材料直接加入到體系中,建立另一種曲霉菌感染的檢測(cè)方法(NASBA-巰基修飾探針-納米金),其結(jié)果同樣既能直接可視化分析又能定量分析,且簡(jiǎn)化了操作。其他方面,有學(xué)者利用NASBA原理,設(shè)計(jì)檢疫芯片,用以快速分析水及食品樣品中酵母菌、大腸桿菌、金葡菌污染[26]。還有學(xué)者[27]將NASBA與熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)相結(jié)合,用于檢測(cè)曲霉菌污染,靈敏度可達(dá)到6×104copies/μL,但設(shè)備要求高,耗時(shí)長(zhǎng)。

此外,若將NASBA用于DNA的檢測(cè),則需要額外預(yù)熱處理,使得它與其他等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相比處于劣勢(shì)。然而,正是因其擴(kuò)增子與產(chǎn)物均為RNA,使得NASBA具有獨(dú)特之處,才使其成為一項(xiàng)值得長(zhǎng)期關(guān)注、值得深入研究的方法。

3 鏈置換擴(kuò)增技術(shù)

SDA是一種酶促DNA體外等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[28],其原理是在引物5′端加上經(jīng)化學(xué)修飾(如dCTPas)的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn),加入的耐高溫限制性內(nèi)切酶(如HsoBI、Hinc II等)無法完全酶切經(jīng)過化學(xué)修飾的位點(diǎn),而是產(chǎn)生單鏈缺口,此時(shí)強(qiáng)鏈置換聚合酶(如exo-Klenow或exo-Bca)從缺口處啟動(dòng)延伸反應(yīng)并將舊鏈剝離,最終達(dá)到指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。包括DNA模板預(yù)熱分離、生成兩端帶酶切位點(diǎn)的擴(kuò)增子、SDA循環(huán)三個(gè)階段,整個(gè)反應(yīng)一般耗時(shí)30 min左右。其常用配套檢測(cè)技術(shù)有瓊脂糖凝膠電泳熒光偏振檢測(cè)法、熒光定量、DNA傳感器、免疫層析等。陳斌等[29]將SDA與DNA傳感器檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合對(duì)33份樣品中銅綠假單胞菌進(jìn)行檢測(cè),并以熒光定量PCR相比較,結(jié)果顯示,兩種方法準(zhǔn)確率一致,但SDA-DNA傳感器法以成本低廉、檢測(cè)速度快更勝一籌。梁煒等[30]以霍亂弧菌ompW為靶向檢測(cè)基因,結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)檢測(cè)食品中的霍亂弧菌,其檢測(cè)限為700 cfu/mL,并以創(chuàng)傷弧菌、志賀氏菌、沙門氏菌等7種常見細(xì)菌為對(duì)照,未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。然而SDA產(chǎn)物不均一,配合瓊脂糖凝膠檢測(cè)時(shí),結(jié)果必然出現(xiàn)拖帶現(xiàn)象,雖然有學(xué)者對(duì)其進(jìn)行過優(yōu)化[31],然而效果不太理想。吳薇等[32]以核酸適體為靶向檢測(cè)對(duì)象,建立了一種SDA與免疫層析雙標(biāo)檢測(cè)法相結(jié)合的方法,用以檢測(cè)腸炎沙門氏菌,其檢測(cè)限為10 cfu/mL,可在1 h內(nèi)完成檢測(cè)。吳薇團(tuán)隊(duì)[33]以同樣的方法,即一種核酸適體進(jìn)行富集分離,以另一種核酸適體為靶向檢測(cè)對(duì)象,建立了SDA與免疫層析相結(jié)合的方法檢測(cè)食品中的大腸桿菌,其檢測(cè)限同樣為10 cfu/mL。該法較其他SDA-base法存在明顯優(yōu)勢(shì),即核酸適體存在于菌體表面,無需進(jìn)行DNA提取,節(jié)約了時(shí)間及經(jīng)費(fèi);此外,因先經(jīng)過了免疫磁珠富集分離,可顯著減少假陽性的出現(xiàn)。Ning等[34]以mecA為靶向檢測(cè)對(duì)象,建立了SDA與熒光定量相結(jié)合的方法檢測(cè)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌,檢測(cè)限為300 cfu/mL。但該法同經(jīng)典SDA-熒光偏振法一樣,對(duì)設(shè)備依賴高,無法適用于設(shè)備情況不理想的地方檢測(cè)機(jī)構(gòu)。

隨著研究的深入,學(xué)者們發(fā)現(xiàn)了SDA存在某些不足,因此對(duì)SDA進(jìn)行了優(yōu)化以規(guī)避其劣勢(shì),如對(duì)體系中離子濃度等進(jìn)行優(yōu)化,以減少其拖帶現(xiàn)象[31];優(yōu)化體系中酶、Buffer的pH及加入特殊物質(zhì)DTT等以提高擴(kuò)增效率及特異性[35]。此外,還有學(xué)者[36]發(fā)現(xiàn)了一種新型鏈置換酶SD DNA polymerase,它除了具備普通DNA擴(kuò)增酶的特性外,還有較Bca更強(qiáng)的鏈置換活性,可顯著提高SDA的擴(kuò)增效率。即便如此,SDA依然存在其無法避免的弊端,如產(chǎn)物兩端帶修飾性的酶切位點(diǎn)且產(chǎn)物不均一,無法用于克隆;現(xiàn)有鏈置換酶不能經(jīng)受高溫預(yù)熱,需在預(yù)熱后加入;酶切位點(diǎn)需經(jīng)過修飾,且修飾成本高等。

4 缺口依賴酶鏈置換技術(shù)

NDA與SDA同樣以鏈置換擴(kuò)增為根本,但其原理略有區(qū)別。針對(duì)SDA必須加入非正常堿基,90年代末,美國NEB公司開發(fā)出一系列缺口酶,它們可以識(shí)別特定位點(diǎn)的雙鏈DNA,并將其切割產(chǎn)生單鏈缺口,而無需依賴于修飾的堿基,降低了反應(yīng)成本。且模板無需進(jìn)行變性,簡(jiǎn)化了操作,提高了效率[37]。即便如此,也未見其在食品檢測(cè)方面的應(yīng)用研究,可能原因是缺口酶會(huì)刺激不依賴模板的DNA合成[38],易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增[39]。

機(jī)器視覺處理和識(shí)別圖像，顏色是重要因素。RGB和HSI是比較常見的兩種顏色模型。RGB顏色模型是基于三基色原理，而HSI顏色模型則是基于色調(diào)、飽和度、和亮度理論原理。采集到的紅棗圖像為RGB圖像，但HSI顏色模型能夠更加自然和直觀地反映人類視覺系統(tǒng)感知色彩的方式[9]。因此，本文首先將獲取的紅棗RGB圖像轉(zhuǎn)換成HSI圖像，利用其顏色的色度、飽和度和亮度3個(gè)基本分量的均值來衡量紅棗的顏色特征。

5 網(wǎng)狀分支擴(kuò)增技術(shù)

RAM是利用環(huán)形寡核脫氧核苷酸探針進(jìn)行核酸擴(kuò)增的方法,即探針5′端和3′端首選與靶基因結(jié)合,在DNA連接酶的作用下形成環(huán)狀探針。以環(huán)狀探針為模板,設(shè)計(jì)引物在鏈置換酶的作用下進(jìn)行擴(kuò)增[40]。為了降低背景和提高檢測(cè)的精準(zhǔn)度,學(xué)者們將其與滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)相結(jié)合,并增加一個(gè)捕獲基因,其上連接生物素標(biāo)記用以熒光或可視化檢測(cè)。如趙春燕等通過利用該法檢測(cè)食品中大腸埃希氏菌和志賀氏菌污染,檢測(cè)限可達(dá)10 cfu/mL[41-42],該法雖然較準(zhǔn)確,但過程復(fù)雜,因其除了RAM反應(yīng)外,還包括環(huán)形探針與捕獲探針的孵育,捕獲探針與磁珠孵育、洗滌、連接、擴(kuò)增、酶切等。其次,設(shè)計(jì)環(huán)形探針與捕獲探針難度大(RAM法最早用于檢測(cè)基因突變,若有一個(gè)堿基不符合要求便無法連接)。因此限制了該法在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用。

另一方面,由于RAM擴(kuò)增產(chǎn)物均為ssDNA,若將RAM與免疫金技術(shù)相結(jié)合,有望實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè),這也是RAM用于食源性致病菌檢測(cè)的新途徑。

6 依賴解旋酶擴(kuò)增技術(shù)

HDA是2014年問世的一項(xiàng)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),其原理為依靠解旋酶(UVR D)的解旋雙鏈形成單鏈DNA,再依靠單鏈結(jié)合蛋白SSB的作用,使模板鏈?zhǔn)冀K處于單鏈狀態(tài),便于引物與之結(jié)合,在65 ℃條件下,90 min內(nèi)完成擴(kuò)增。

目前,HDA已被用于溶血性弧菌[43]、單增李斯特菌[44]及沙門氏菌[45]的檢測(cè),其檢測(cè)限分別可達(dá)到19.9 ng、780 cfu/mL、460 pg。上述研究均以瓊脂糖凝膠電泳為檢測(cè)手段,然而HDA依賴于解旋酶的解旋作用,目前常用的大腸桿菌UvrD解旋速率在20 bp/s左右,連續(xù)性一般為100 bp,使得擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度受限,僅為70～120 bp,使得瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)辨識(shí)度降低,特別是若引物存在二聚體,或體系中引物加入量過大,造成假陽性的出現(xiàn)。對(duì)此,Jeong等[46]發(fā)現(xiàn)了一種T7噬菌體GP4解旋酶,該酶解旋速率及連續(xù)性均較UvrD高,提高了HDA的擴(kuò)增速度與目的片段長(zhǎng)度。

此外,Chen等[47]將HDA與免疫磁珠相結(jié)合,建立熒光定量HDA法檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌,檢測(cè)限提高為50 cfu/mL;Gill等[48]將HDA與納米金技術(shù)相結(jié)合建立了幽門螺桿菌可視化檢測(cè)方法,檢測(cè)限可高達(dá)10 cfu/mL。

其主要缺陷在于,相比其他等溫?cái)U(kuò)增方法如RPA,HDA的反應(yīng)時(shí)間稍長(zhǎng)。因此,開發(fā)高效且優(yōu)質(zhì)的新型解旋酶應(yīng)該是其今后的重點(diǎn)研究方向。

7 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)

近年來,隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展,RPA技術(shù)的出現(xiàn),將致病菌核酸水平的檢測(cè)推上一個(gè)新高度。其原理為:重組酶與引物結(jié)合形成的蛋白-DNA復(fù)合物,能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列,就會(huì)發(fā)生鏈交換反應(yīng)形成并啟動(dòng)DNA合成,對(duì)模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。被替換的DNA鏈與SSB結(jié)合,防止進(jìn)一步替換。上述3種酶在37 ℃時(shí)活性高,因此使得RPA技術(shù)可在常溫下進(jìn)行擴(kuò)增,降低了對(duì)儀器設(shè)備的要求,同時(shí)大大縮減了檢測(cè)時(shí)間,可以在15 min內(nèi)完成擴(kuò)增,提高了檢測(cè)效率。其配套檢測(cè)方法一般包括瓊脂糖凝膠電泳、熒光定量、測(cè)流層析、納米金等。近幾年廣泛應(yīng)用于疾病診斷[49-51]、轉(zhuǎn)基因作物篩選[52-54]、致病菌檢測(cè)[14,55-58]等。

在致病菌檢測(cè)方面,劉立兵[55]以侵襲蛋白invA作為檢測(cè)基因,建立了基礎(chǔ)RPA檢測(cè)食品中沙門氏菌的方法,并與熒光定量PCR法進(jìn)行對(duì)比,準(zhǔn)確性一致,其檢測(cè)限能達(dá)到1.1×10-3ng/μL。經(jīng)過8 h的增菌處理后,4 cfu/mL的污染可以被檢出。但較普通PCR,其缺陷在于,不僅增菌之后需要DNA提取純化,且擴(kuò)增后的產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)前,還需再純化一次,操作過于繁瑣。隨后,有學(xué)者[56]以蠟樣芽孢桿菌16S RNA設(shè)計(jì)引物與探針,建立了熒光定量PRA的方法檢測(cè)食品中蠟樣芽孢桿菌。檢測(cè)限為1.0×10-3ng/μL,可在39 ℃ 20 min完成擴(kuò)增。并與沙門氏菌、志賀氏菌等28種細(xì)菌做對(duì)比,未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。熒光法雖無需進(jìn)行DNA純化和電泳,但對(duì)設(shè)備要求高。

為降低對(duì)設(shè)備的要求,學(xué)者們結(jié)合免疫金技術(shù),建立了一種地高辛與生物素雙標(biāo)的測(cè)流層析RPA法檢測(cè)食品中李斯特菌[57]與沙門氏菌[58],經(jīng)過20 min的擴(kuò)增,檢測(cè)限分別能達(dá)到15、10 cfu/mL,且可以達(dá)到可視化要求。然而,由于免疫金及雙標(biāo)試紙條制作繁瑣且價(jià)格昂貴,可能限制該法的推廣。

為降低檢測(cè)成本和簡(jiǎn)化操作,唐毓祎[14]將未修飾的納米金顆粒,直接加入到RPA體系中,建立了一種未修飾AuNPs-RPA的方法,用于檢測(cè)水產(chǎn)品中的弧菌污染。根據(jù)AuNPs與酶、及單鏈DNA的相互結(jié)合的原理,擴(kuò)增后的陽性管呈現(xiàn)出藍(lán)色,而未擴(kuò)增的陰性對(duì)照AuNPs與酶及引物的作用始終在一個(gè)恒穩(wěn)的狀態(tài),最終還是紫色。該法實(shí)現(xiàn)了可視化檢測(cè),且經(jīng)20 min的擴(kuò)增反應(yīng)后檢測(cè)限可達(dá)到50 cfu/mL,較LFD法極大地降低了檢測(cè)成本,同時(shí)也縮短了檢測(cè)時(shí)間。

總之,RPA是一種新興技術(shù),在近三年間急速發(fā)展起來,在食源性致病菌檢測(cè)方面也具有廣闊前景。

8 結(jié)論與展望

上述各等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)溫度要求、反應(yīng)時(shí)間、引物對(duì)數(shù)及其產(chǎn)物類型總結(jié)見表1;相比傳統(tǒng)PCR,等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)具有一個(gè)最顯著的特點(diǎn),無需依賴于昂貴的金屬浴儀器,可在硬件設(shè)施不理想的基層食品檢測(cè)中心推廣;并且等溫?cái)U(kuò)增引物不同于傳統(tǒng)PCR引物,不受退火溫度的限制,因此,其在多重?cái)U(kuò)增上的優(yōu)勢(shì)也是傳統(tǒng)PCR無法超越的;此外,等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的精確性或特異性依賴于擴(kuò)增反應(yīng)所用酶的保真性以及引物和靶向基因選擇的合理性,因此引物的優(yōu)化和靶向基因的合理選擇是方法是否適用的關(guān)鍵;目前等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)常用配套檢測(cè)手段包括瓊脂糖凝膠電泳、熒光檢測(cè)、免疫層析技術(shù)、免疫磁珠技術(shù)、納米金技術(shù)、基因芯片、熒光偏振、化學(xué)可視化反應(yīng)等,因不同等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)特點(diǎn)不同,在實(shí)際操作過程中需根據(jù)其特點(diǎn)和檢測(cè)的具體要求選擇恰當(dāng)?shù)呐涮讬z測(cè)手段,如LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物呈階梯狀凝膠電泳檢測(cè)極其不準(zhǔn)確,RPA擴(kuò)增產(chǎn)物需純化回收才能進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,又如RAM產(chǎn)物多為單鏈DNA,為納米金可視化檢測(cè)提供了條件,而NASBA產(chǎn)物為單鏈RNA,為探針法檢測(cè)提供了方便;另一方面,等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相比與傳統(tǒng)PCR,在檢測(cè)細(xì)菌時(shí)必須進(jìn)行DNA提取純化,使其依然難以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)化快速檢測(cè),且目前未見關(guān)于DNA提取過程優(yōu)化的相關(guān)研究報(bào)道,因此,對(duì)該步驟的優(yōu)化改良是其重要的研究方向之一。

表1 各等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的溫度要求、反應(yīng)時(shí)間、引物對(duì)數(shù)及其產(chǎn)物類型Table 1 Temperature requirements,reaction times,primers,and it’s products for each isothermal amplification technique

食品是人類賴以生存的物質(zhì)基礎(chǔ),食品安全是關(guān)系到社稷民生的重大問題,對(duì)致病菌的監(jiān)控檢測(cè)是食品安全的重要任務(wù),分子生物方法是致病菌檢測(cè)的重要手段之一。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展,DNA及基因組測(cè)序技術(shù)的不斷成熟,各種致病菌基因信息的獲得將更廉價(jià)、更快捷,等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在食源性致病菌檢測(cè)中扮演的角色也將越來越重要。隨著越來越多食源性致病菌的基因信息被獲得,有望直接通過多重等溫?cái)U(kuò)增實(shí)現(xiàn)致病菌定量檢測(cè)、細(xì)菌分型、毒力分析、生化特性分析的“一條龍服務(wù)”,取代目前常用的繁瑣的血清型試驗(yàn)及生化試驗(yàn)。

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)作為致病菌檢測(cè)的后起之秀,以現(xiàn)代高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展作為其堅(jiān)實(shí)的后盾,隨著研究不斷的深入,其缺陷被不斷完善改良,相信在不久的將來,等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)將成為致病菌檢測(cè)中一個(gè)重要的方法。