土霉素處理對(duì)柑橘黃龍病的防治效果及PP2基因表達(dá)的影響

姚廷山，周彥，Diann Achor，王年，周常勇

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土霉素處理對(duì)柑橘黃龍病的防治效果及PP2基因表達(dá)的影響

姚廷山1,2，周彥1，Diann Achor3，王年3，周常勇1,2

（1西南大學(xué)/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，中國重慶 400712；2西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，中國重慶 400716；3美國佛羅里達(dá)大學(xué)柑橘教育 與研究中心，美國佛羅里達(dá) 33850）

【目的】評(píng)價(jià)土霉素(oxytetracycline，OTC)藥劑對(duì)不同發(fā)病程度柑橘黃龍?。℉uanglongbing，HLB）的防治效果，并檢測(cè)OTC處理后韌皮部關(guān)鍵基因——韌皮部蛋白2（PP2）的表達(dá)量變化，為HLB的有效防控提供科學(xué)依據(jù)，也為OTC作用機(jī)理研究提供參考?！痉椒ā繎?yīng)用可有效抑制、殺死病原菌的OTC，樹干定量注射0.1 g/樹于不同發(fā)病程度HLB（初感染、輕度發(fā)病和重度發(fā)病3組）的4年生Valencia夏橙，注射后7、30、60、90 d定期采集Valencia葉片樣品監(jiān)測(cè)HLB致病菌Liberibacter asiaticus(Las)含量、淀粉含量及PP2基因表達(dá)量變化。樹干注射OTC后90 d采集不同處理Valencia的嫩葉、成熟葉片及莖，進(jìn)行淀粉染色光學(xué)顯微觀察（LM），直觀反映植株累積淀粉的變化。樹干注射OTC后80 d調(diào)查柑橘嫩葉抽發(fā)的情況，綜合一系列指標(biāo)評(píng)價(jià)OTC對(duì)HLB的防治效果?！窘Y(jié)果】注射OTC 0.1 g/樹對(duì)初感染HLB的4年生Valencia植株治療作用最明顯，7 d后檢測(cè)即為陰性，并可保持90 d，其成熟葉片的淀粉含量明顯減少，但莖內(nèi)仍有淀粉粒富集；輕度發(fā)病夏橙注射90 d后葉片內(nèi)的Las含量從（1.68×106±858884）cells/g葉片減至（7.21×104±30981）cells/g葉片，下降幅度極為明顯，其成熟葉片內(nèi)的淀粉含量在90 d內(nèi)一直呈下降趨勢(shì)；重度發(fā)病植株注射后葉片內(nèi)的Las含量從（4.10×108±3.04×108）cells/g葉片減至（2.80×107±2.70×107）cells/g葉片，但從數(shù)量而言仍然有較多分布，除了新長出的秋梢，其成熟葉及莖內(nèi)的淀粉粒含量仍舊很大，說明0.1 g/株OTC不足以治愈4年生重度發(fā)病Valencia夏橙。對(duì)PP2基因表達(dá)分析結(jié)果顯示，注射OTC后30 d，Valencia夏橙體內(nèi)的PP2基因表達(dá)量大幅度下降，隨后90 d內(nèi)表達(dá)量穩(wěn)定，與注射后30 d的表達(dá)量較為一致?！窘Y(jié)論】OTC可以用于HLB的防控，對(duì)初感染（Las含量為＜9.00×105cells/g葉片）及輕度發(fā)?。↙as含量為9.00×105—9.00×107cells/g葉片）的柑橘植株治療作用較好，不適用于重度發(fā)病植株（Las含量為＞9.00×107cells/g葉片）的治療。注射OTC后，PP2基因表達(dá)量下降明顯，說明OTC可有效減少韌皮部病菌等的脅迫壓力。

黃龍??；Liberibacter asiaticus（Las）；土霉素；淀粉；韌皮部蛋白2

0 引言

【研究意義】柑橘黃龍?。℉uanglongbing，HLB）是世界柑橘產(chǎn)業(yè)的毀滅性傳染病害，病原為一種寄生于韌皮部篩管組織的革蘭氏陰性細(xì)菌，可導(dǎo)致葉片黃化、果實(shí)畸形早落、種子敗育及根系腐爛，直至樹體死亡[1-3]。HLB病原菌分為亞洲種. L. asiaaticus（Las）[4]、非洲種. L. africanus（Laf）[5]和美洲種. L. americanus（Lam）[6-7]，其中Las及其傳播媒介昆蟲亞洲柑橘木虱（ACP，）在全球分布最普遍，危害也最嚴(yán)重。迄今為止，HLB無抗病品種且病原仍無法分離培養(yǎng)，導(dǎo)致其有效防控研究進(jìn)展緩慢，給柑橘產(chǎn)業(yè)帶來了前所未有的挑戰(zhàn)[8]。因此有效抑制植株中黃龍病菌的含量是當(dāng)前研究的重點(diǎn)內(nèi)容[9]，開展對(duì)目前唯一明確能直接殺死HLB病菌的抗生素的效果評(píng)價(jià)及作用機(jī)制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究表明，大量噴施農(nóng)藥殺滅亞洲柑橘木虱及移除HLB病樹的聯(lián)合防控方法花費(fèi)巨大且效果不明顯，尤其地勢(shì)平坦或颶風(fēng)、臺(tái)風(fēng)等影響地區(qū)，無法控制亞洲柑橘木虱的擴(kuò)散[9]。柑橘抗病育種和亞洲柑橘木虱的遺傳轉(zhuǎn)化途徑研究為HLB的防控提供了希望，但離田間有效應(yīng)用還有較大距離[10-11]?？股厥悄壳拔ㄒ幻鞔_能直接殺死HLB病菌的化學(xué)藥物，在溫網(wǎng)室試驗(yàn)中，土霉素（OTC）可高效抑制HLB病菌[12-13]，但噴施的OTC很難進(jìn)入葉片組織，只能通過抑制葉表面的其他細(xì)菌來保護(hù)植株生長[14]，光照和降雨會(huì)加速OTC的流失，影響周邊環(huán)境[15]，因此需要建立替代方法來提高OTC的防治效果，同時(shí)減少對(duì)環(huán)境的影響。樹干注射是直接將化學(xué)物質(zhì)或營養(yǎng)物質(zhì)輸送到植物體內(nèi)的目標(biāo)精確、環(huán)境友好的方法，在植物營養(yǎng)供給和病蟲害防控中被廣泛應(yīng)用[16-17]。亞洲和南非曾用樹干注射殺菌劑進(jìn)行HLB防控，但因其勞動(dòng)力及設(shè)備費(fèi)的高昂而推廣受限。此外，樹干注射OTC后一旦停止用藥，次年HLB還會(huì)復(fù)發(fā)[18-19]。近期迫于HLB的嚴(yán)重威脅，美國佛羅里達(dá)州已放開對(duì)OTC的使用，并開展藥劑篩選、施用方法等研究[9,13]。HLB病原菌在柑橘韌皮部繁殖及擴(kuò)展，因此具有維持植物形態(tài)、運(yùn)轉(zhuǎn)內(nèi)部物質(zhì)及愈合傷口等功能的韌皮部蛋白成為研究焦點(diǎn)[20-21]。尤其是韌皮部蛋白中含量最多的一種通過二硫鍵共價(jià)連接的二聚體多聚GlcNAc結(jié)合凝集素，即韌皮部蛋白2（phloem protein 2，PP2）[22]。免疫細(xì)胞化學(xué)定位研究顯示，PP2不僅分布于伴胞，在植物篩管分子中也有分布[23-24]，由于堵塞韌皮部中的篩管是黃龍病菌致病的主要方式，因此PP2蛋白可能成為HLB防控的關(guān)鍵?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】然而，OTC對(duì)HLB發(fā)病程度不同柑橘的治療效果尚未研究，施用OTC與柑橘韌皮部關(guān)鍵基因PP2的關(guān)系也未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】應(yīng)用qRT-PCR、高效液相色譜（HPLC）等監(jiān)測(cè)植株中Las、OTC和PP2基因的含量變化，評(píng)價(jià)OTC對(duì)不同患病程度柑橘的治療效果，探索OTC防控HLB的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017年在美國佛羅里達(dá)大學(xué)柑橘研究與教育中心完成。

1.1 供試材料

供試柑橘為4年生Valencia夏橙（），由美國佛羅里達(dá)大學(xué)柑橘研究與教育中心提供。2017年3月放置于溫室中保存。定期澆水并每3個(gè)月使用“Citrus gain”肥料（Bougainvillea Growers International，St. James City，F(xiàn)L，USA）提供礦物質(zhì)營養(yǎng)。

藥劑：Agro-OTC（FireLine 17WP，AgroSource，Inc.）。

1.2 供試材料分組

根據(jù)檢測(cè)的Las基因組拷貝數(shù)進(jìn)行分組，分為初感染、輕度發(fā)病及重度發(fā)病3組，每組3株Valencia重復(fù)。試驗(yàn)選擇Valencia夏橙成熟葉片（1年葉），使用直徑0.9 cm打孔器在植株東西南北中5個(gè)方位各選取1片葉打孔取樣，Wizard Genomic DNA純化試劑盒（Promega）提取基因組DNA。純度及濃度檢測(cè)后稀釋至10 ng?μL-1作為qRT-PCR擴(kuò)增模板。20 μL qRT-PCR反應(yīng)體系：2 μL模板，2×mix 10 μL（Qiagen，Valencia，CA），10 μmol?L-1上/下游引物CQULA04F（5′-TGGAGGTGTAAAAGTTGCCAAA）/CQULA04R（5′-CCAACGAAAAGATCAGATATTCCTCTA）各1 μL[25]，10 μmol?L-1Probe（序列）0.5 μL（Qiagen，Valencia，CA），ddH2O 5.5 μL[26]。反應(yīng)程序：95℃ 15 min預(yù)變性；94℃ 15 s，60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增。所有qRT-PCR反應(yīng)在ABI PRISM 7500實(shí)時(shí)PCR儀中進(jìn)行（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA）。通過質(zhì)粒制作標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算樣品中的Las基因組拷貝數(shù)[26]。應(yīng)用軟件QuantStudioTMDesign&Analysis Softwarev1.4.1進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3 樹干注射OTC處理及Las含量分析

選用Chemjet tree Injector注射器于2017年7月10日在發(fā)病程度不同的3組柑橘樹上注射Agro-OTC 0.25 g/樹（相當(dāng)于鹽酸土霉素活性成分0.1 g/樹），每處理重復(fù)3次，每組處理均設(shè)清水對(duì)照。健康植株與患HLB植株的物候期不同[27-28]，選擇Valencia夏橙成熟葉片（1年葉），注射OTC后7、30、60及90 d使用直徑0.9 cm打孔器在植株東西南北中5個(gè)方位各選取1片葉打孔取樣，參考1.2應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)柑橘體內(nèi)Las的含量，并做統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 淀粉含量測(cè)定

注射后7、30、60及90 d，從同株樹的3個(gè)不同方向各選1片成熟葉（1年葉），打孔得到3個(gè)直徑0.6 cm的葉盤，重復(fù)3次，葉盤混合并用鋼珠均質(zhì)化后，沸水加熱10 min，2 500 r/min離心2 min，上清液用于淀粉含量檢測(cè)。淀粉檢測(cè)參照I2/KI方法進(jìn)行，以水稻淀粉（Sigma Aldrich，St. Louis，MO，USA）為標(biāo)樣，加入I2/KI 50 μL使淀粉顯色，594 nm處監(jiān)測(cè)淀粉含量[26,29]。

1.5 淀粉染色觀察（light microscopy，LM）

OTC注射前及注射后90 d，分別采集HLB初感染及HLB嚴(yán)重患病兩組植株的成熟葉（1年葉）、嫩葉及莖組織，用潔凈刀片將莖和葉片主脈切2 mm×3 mm小塊，置于組織固定液（3%戊二醛溶于0.1 mol?L-1pH 7.2的磷酸鉀緩沖液）固定，4℃過夜。經(jīng)脫水、滲透、包埋及超薄切片后，用光學(xué)顯微鏡觀察組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)及淀粉粒分布[30]。

1.6 韌皮部PP2基因表達(dá)

應(yīng)用輕度發(fā)病Valencia夏橙植株為供試植物，參照Rawat等[31]對(duì)DNA的微陣列（Microarray）差異表達(dá)基因的探針信息設(shè)計(jì)引物，分析Valencia夏橙植株在注射OTC后，韌皮部關(guān)鍵基因PP2的變化情況。探針I(yè)D為Cit_35955_1_S1_at_C，引物序列為23F（5′-TCGTTGCCATCAGAAGTATCAC），23R（5′-CCAACGCAAATAAACTGTCCC）。在Valencia植株樹干注射OTC 0.1 g/樹后的0、30、60及90 d分別取樣，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室中于-80℃冰箱中保存，設(shè)置Las含量相當(dāng)?shù)腣alencia清水對(duì)照，均3株樹重復(fù)，每株取東西南北中5張葉片混樣。采用試劑盒RNeasy Mini Kit（Qiagen，Valencia，CA）抽提葉片總RNA，TURBO DNA-free kit（Ambion，Austin，TX）去除其中的DNA，經(jīng)ND-8000 Nanodrop分光光度計(jì)（NanoDrop Technologies，Wilmington，DE）測(cè)定RNA的濃度和純度，A260/A280＞2.0，濃度＞100 μg?μL-1為符合試驗(yàn)要求RNA。取RNA樣品產(chǎn)物2 μL反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于qRT-PCR對(duì)cDNA樣品進(jìn)行基因表達(dá)水平檢測(cè)。候選內(nèi)參基因選擇柑橘甜橙甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（5′-GGAAGGTCAAGATCGGAATCAA/5′- CGTCCCTCTGCAAGATGACTCT），按ΔCT法分析目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量及其標(biāo)準(zhǔn)差[32]。運(yùn)用SPSS 13.0進(jìn)行單因素方差分析和Duncan檢驗(yàn)，采用Prism 7.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及圖表繪制。

1.7 營養(yǎng)階段發(fā)育參數(shù)

不同發(fā)病程度的Valencia夏橙組樹干注射OTC 0.1 g/樹后80 d，即2017年9月30日調(diào)查植株新梢和葉片數(shù)，記錄后用Prism7.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及圖表繪制。每個(gè)不同發(fā)病程度組分別設(shè)置清水注射為對(duì)照，并且設(shè)置健康Valencia植株樹干注射OTC 0.1 g/樹與注射清水為對(duì)照，3次重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 供試材料Valencia植株分組

供試Valencia植株的Las含量差異較大，發(fā)病程度也不相同。本研究依據(jù)Valencia葉片中的Las含量，將植株分為初感染、輕度發(fā)病及重度發(fā)病3組，每組3個(gè)重復(fù)。3組發(fā)病程度不同植株各設(shè)注射清水對(duì)照，每組3個(gè)重復(fù)。具體為初感染HLB的Valencia植株的葉片Las含量為＜9.00×105cells/g葉片，輕度發(fā)病植株的葉片Las含量為9.00×105—9.00×107cells/g葉片，重度發(fā)病植株的葉片Las含量為＞9.00×107cells/g葉片（表1）。

2.2 樹干注射OTC后葉片Las含量變化

注射OTC后病株中Las的含量顯著下降，其中對(duì)初感染HLB的植株治療作用最明顯，藥后7、30、60及90 d檢測(cè)結(jié)果均為陰性（圖1-A）。其他兩組Valencia夏橙植株在注射后7 d，Las含量均明顯減少，藥后90 d，輕度發(fā)病組的葉片Las含量從（1.68×106±858884）cells/g葉片減至（7.21×104±30981）cells/g葉片，下降幅度極為明顯，部分植株在注射藥劑后60 d及90 d的檢測(cè)結(jié)果為陰性，但輕度發(fā)病對(duì)照組Las含量從（1.15×107±8489766）cells/g葉片增至（5.62×107± 2.10×107）cells/g葉片（圖1-B）；重度發(fā)病組從（4.10× 108±3.04×108）cells/g葉片減至（2.80×107±2.70×107）cells/g葉片，而重度發(fā)病對(duì)照組從（4.70×108± 2.32×108）cells/g葉片增至（9.71×108±4.61×108）cells/g葉片（圖1-C）。結(jié)果表明，注射OTC 0.1 g/株后，可有效降低Las在柑橘體內(nèi)的含量，初感染HLB植株在3個(gè)月內(nèi)基本可以治愈，輕度發(fā)病植株部分可表現(xiàn)為陰性，重度發(fā)病植株體內(nèi)Las含量有效減少。

2.3 淀粉含量變化

注射OTC后，HLB發(fā)病程度不同的植株淀粉含量均有所下降，初感染HLB植株葉片的淀粉含量在注射后7 d、輕度發(fā)病植株在注射后60 d下降最明顯。重度發(fā)病植株在注射后7 d與30 d下降且葉片內(nèi)淀粉含量相當(dāng)，在注射后60 d及90 d降至更低水平，且60 d與90 d時(shí)葉片內(nèi)淀粉含量相當(dāng)。初感染HLB植株在注射OTC 0.1 g/株后90 d內(nèi)，葉片內(nèi)淀粉含量均保持在＜2 μg?mm-2；輕度發(fā)病植株葉片注射后90 d比60 d略有升高；重度發(fā)病植株葉片注射后7 d，葉片內(nèi)淀粉含量變化明顯，但7—90 d淀粉含量變化較?。▓D2）。

不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同

表1 基于植株葉片中Las含量的Valencia分組

顯微觀察表明，夏橙HLB重度發(fā)病組的老葉、嫩葉及莖中的淀粉含量及密度皆明顯高于初感染HLB的柑橘組，在3種組織中莖觀察的淀粉粒沉積量最大，也最密集。注射OTC后，HLB患病嚴(yán)重程度不同的各處理淀粉粒清除作用也不相同。注射OTC對(duì)夏橙各組織的影響不同，初感染HLB的嫩葉在注射前后均觀察不到淀粉粒的存在；注射前的老葉上有少量淀粉粒沉積，注射后90 d，淀粉粒沉積有所減少但在老葉組織內(nèi)仍有明顯分布；莖中的淀粉粒在注射OTC前后均有較多分布；HLB重度發(fā)病植株的老葉、嫩葉及莖中在注射之前均有大量淀粉粒分布，注射OTC后90 d，老葉及莖中的淀粉粒含量有所減少，但是仍有較多淀粉粒分布（圖3）。

圖2 患HLB夏橙注射OTC后葉片中的淀粉含量變化

2.4 嫩梢（葉）抽發(fā)

2017年7月10日Valencia夏橙春梢葉片近成熟時(shí)注射0.1 g/株OTC，注射后80 d調(diào)查秋梢嫩梢和葉抽發(fā)情況。結(jié)果表明，Valencia夏橙注射OTC 0.1 g/樹后，初感染HLB和輕度發(fā)病兩組嫩梢抽發(fā)量顯著高于未注射OTC的植株，HLB重度發(fā)病注射組的嫩梢抽發(fā)多于未注射組，但差異不顯著。初感染HLB和輕度發(fā)病兩組注射OTC后的嫩梢抽發(fā)量無顯著差異，但顯著高于HLB重度發(fā)病注射組。嫩葉抽發(fā)與嫩梢的分析結(jié)果較為相似，但發(fā)病重的Valencia夏橙的嫩葉抽發(fā)數(shù)量會(huì)減少。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，OTC注射HLB輕度發(fā)病組的嫩葉抽發(fā)數(shù)顯著少于HLB初感染的OTC注射組，而顯著多于HLB重度發(fā)病的OTC注射組。值得注意的是，HLB感染程度不同的3組未注射OTC的Valencia夏橙的嫩梢抽發(fā)和嫩葉抽發(fā)均無顯著差異（圖4）。

1：初感染植株（處理）Newly infected plant (Treatment)；2：初感染植株（對(duì)照）Newly infected plant (CK)；3：輕度發(fā)病植株（處理）Mild infected plant (Treatment)；4：輕度發(fā)病植株（對(duì)照）Mild infected plant (CK)；5：重度發(fā)病植株（處理）Severely infected plant (Treatment)；6：重度發(fā)病植株（對(duì)照）Severely infected plant (CK)；7：健康植株（處理）Healthy plant (Treatment)；8：健康植株（對(duì)照）Healthy plant (CK)

圖4 Valencia夏橙注射OTC后嫩梢（葉）抽發(fā)變化

Fig. 4 The change of new shoot (leaf) of Valencia after OTC trunk injection

2.5 韌皮部PP2基因表達(dá)

注射OTC 0.1 g/樹后30 d，供試Valencia夏橙的PP2基因表達(dá)量顯著降低。注射后30、60及90 d處理株和健康對(duì)照株的PP2基因表達(dá)均無顯著差異。Valencia夏橙植株注射OTC后，韌皮部關(guān)鍵誘導(dǎo)表達(dá)基因PP2的表達(dá)量大幅下降，推測(cè)注射OTC后顯著降低了植株組織內(nèi)Las的含量及淀粉沉積量，減少了柑橘韌皮部所受的脅迫，引起PP2的表達(dá)量減少（圖5）。

3 討論

柑橘黃龍?。℉LB）因其病原菌不能培養(yǎng)，導(dǎo)致防控難度極大。目前，科研工作者已提出激素處理、肥力措施及抗病性育種等方法防控HLB，也嘗試通過遺傳措施改造其傳播媒介亞洲柑橘木虱，這些方法雖然具有解決HLB問題的潛力，但離田間應(yīng)用還有較大差距[10,26,33]。前人研究表明，單用或混用OTC皆可較好防控HLB[9,34-36]，但一旦停止用藥，HLB會(huì)再次發(fā)生。本研究將患有HLB Valencia植株通過qRT-PCR檢測(cè)體內(nèi)Las豐度后分為初感染、輕度發(fā)病及重度發(fā)病3組。3組不同患病程度的Valencia植株分別注射OTC 0.1 g/株后，應(yīng)用qRT-PCR、淀粉染色觀察、淀粉含量測(cè)定等技術(shù)檢測(cè)注射后90 d內(nèi)OTC對(duì)患病程度不同的3組夏橙的作用效果，并對(duì)韌皮部關(guān)鍵基因PP2表達(dá)進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，患有不同程度HLB的Valencia夏橙植株在注射OTC0.1g/株后，體內(nèi)Las含量均下降明顯，淀粉粒含量也有較大下降。初感染HLB的4年生Valencia植株，通過注射0.1 g/株OTC，可以在90 d內(nèi)基本清除植株體內(nèi)Las危害；HLB輕度發(fā)病植株在注射OTC后，開始時(shí)Las的清除作用不明顯，60—90 d有顯著下降，90 d個(gè)別植株基本恢復(fù)健康；重度患病的柑橘植株體內(nèi)Las含量及淀粉粒含量仍保持較高水平，推測(cè)這是前期報(bào)道的樹干注射OTC后HLB會(huì)復(fù)發(fā)的重要原因之一。增加OTC注射次數(shù)或注射量，或許可更有效防控HLB，但需監(jiān)控OTC在植物組織尤其是果實(shí)內(nèi)的殘留量，應(yīng)綜合考慮OTC的劑量和靶標(biāo)樹的平衡關(guān)系，尋找最佳OTC注射量。

Las危害柑橘后，可造成淀粉累積及根系損壞，吸收能力下降，營養(yǎng)缺乏，從而抽梢困難。柑橘抽不出新梢即為生長受到阻撓，進(jìn)而影響掛果。本研究表明，注射OTC 0.1 g/樹于4年生Valencia上，可增加秋梢的發(fā)生量，初感染HLB植株在注射OTC 0.1 g/樹后的嫩梢抽發(fā)量與健康植株相當(dāng)。后續(xù)研究可聚焦于OTC樹干注射后對(duì)HLB發(fā)病植株根系的影響。值得注意的是，通過人工或化學(xué)方法殺梢，可減少HLB傳播媒介柑橘木虱的產(chǎn)卵場(chǎng)所，是目前國內(nèi)防控HLB的有效方法之一，可大大減少木虱蟲源，從而降低黃龍病的發(fā)生。如何來平衡促進(jìn)新梢抽發(fā)及殺梢減少柑橘木虱蟲源之間的關(guān)系，也是未來研究值得關(guān)注的問題。

韌皮部蛋白因Las在韌皮部危害和繁殖而成為研究的重點(diǎn)，存在于篩管分子中并具有ATPase活性，被認(rèn)為與篩管中的物質(zhì)運(yùn)輸有關(guān)[37]。研究表明，感染HLB的植株在篩板的篩孔中伴隨有胼胝質(zhì)和P蛋白沉積，導(dǎo)致韌皮部堵塞，光合產(chǎn)物運(yùn)輸受阻，葉肉中淀粉過度積累，葉綠素被破壞，最終失綠[38-39]。PP2基因沉默或胼胝質(zhì)沉積相關(guān)基因沉默可能是減緩柑橘黃龍病癥狀的有效途徑。本研究表明，注射OTC后，患HLB植株P(guān)P2基因表達(dá)量大大減少，而健康植株的表達(dá)量基本不變，推測(cè)注射OTC后減少了柑橘韌皮部所受的脅迫，該結(jié)果可為今后防控機(jī)理研究及防治方法改進(jìn)提供一定的參考。

4 結(jié)論

樹干注射0.1 g/株土霉素（OTC）可有效治療4年生Valencia夏橙黃龍?。℉LB）初感染植株及部分輕度發(fā)病植株，使其檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)為陰性；不能使重度發(fā)病柑橘植株恢復(fù)健康，但可有效減少其體內(nèi)的Las含量及沉積的淀粉粒含量。樹干注射OTC后，可促進(jìn)患HLB植株嫩梢抽發(fā)，減少韌皮部關(guān)鍵基因PP2的表達(dá)量，并至少90 d可維持這一水平，表明OTC可有效減少韌皮部病菌等的脅迫壓力。

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effects of Oxytetracycline Treatment on the control of sweet orange Huanglongbing and the expression of PP2 gene

YAO TingShan1,2, ZHOU Yan1, Diann Achor3, WANG Nian3, ZHOU ChangYong1,2

(1Citrus Research Institute, Southwest University/Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 400712, China;2College of Plant Protection, Southwest University, Chongqing 400716, China;3Citrus Research and Education Center, University of Florida, Lake Alfred, Florida 33850, USA)

【Objective】The objective of this study is to evaluate the control efficacy of oxytetracycline (OTC) on sweet orange Huanglongbing (HLB), detect the expression of phloem protein 2 (PP2) gene, and to provide a scientific basis for the effective prevention and control of HLB as well as a reference for OTC mechanism research. 【Method】OTC, which can effectively inhibit and kill pathogenic bacteria, was injected with 0.1 g/tree of 4-year-old Valencia sweet orange with different severity of HLB (newly infected, mild infected and severely infected plants), and then the contents ofLiberibacter asiaticus (Las), starch and PP2 gene of leaves were evaluated at 7, 30, 60, 90 days post injection, respectively. Furthermore, 90 days after injection, the young and mature tissues of the plants were observed by using starch staining light microscopy (LM). The extraction of tender leaves was investigated 80 days after OTC injection. 【Result】Trunk injection of OTC 0.1 g/tree had the most obvious therapeutic effect on newly infected Valencia sweet orange. Seven days after injection, Las could not be detected and it maintained for 90 days. The starch content in mature leaves decreased obviously, but starch grains were still enriched in stems. The Las content of mild infected Valencia leaves decreased from (1.68×106±858884) cells/g leaf to (7.21×104±30981) cells/g leaf, the descending range was obvious, and the starch content in mature leaves showed a decreasing trend within 90 days. The Las content of severely infected Valencia leaves decreased from (4.10×108±3.04×108)cells/g leaf to (2.80×107±2.70×107)cells/g leaf, but the starch content in mature tissues of severely infected plants was still high, except the newly autumn shoots. The results indicated that 0.1 g/tree OTC was not enough to cure 4-year-old severely infected Valencia. The expression of PP2 gene in Valencia significantly decreased 30 days after OTC injection, and remained stable in the subsequent 90 days, which was consistent with the expression level at 30 days after injection.【Conclusion】OTC can be used in the prevention and control of HLB, and has better therapeutic effect on newly infected Valencia (Las content is less than 9.00×105cells/g leaf) and mild infected Valencia (Las content is 9.00×105-9.00×107cells/g leaf). It was not suitable for the treatment of severely infected plants (Las content is more than 9.00×107cells/g leaf). After injection of OTC, the expression of PP2 gene decreased obviously, suggesting that OTC can effectively reduce the stress of phloem pathogens.

Huanglongbing (HLB);Liberibacter asiaticus (Las); oxytetracycline (OTC); starch; PP2

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.07.010

2018-11-23；

2019-01-23

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFD0201500）、重慶市自然科學(xué)基金（cstc2016jcyjA0118）

姚廷山，Tel：023-68349005；E-mail：yts103xt@cric.cn。通信作者周常勇，E-mail：zhoucy@cric.cn

（責(zé)任編輯 岳梅）