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    低溫條件下小麥返白系葉片中H2O2累積的原因初探

    2019-04-12 08:31:56李瑞航謝利萍邵景俠郭藹光
    麥類(lèi)作物學(xué)報(bào) 2019年3期
    關(guān)鍵詞:質(zhì)體光化學(xué)復(fù)合體

    肖 磊,楊 苑,李瑞航,謝利萍,邵景俠,郭藹光,2,徐 虹,2

    (1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)生命學(xué)院,陜西楊凌 712100; 2.旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西楊凌 712100)

    本研究用二甲基聯(lián)苯胺(DAB)組織染色法測(cè)定返白系和矮變1號(hào)在4 ℃持續(xù)低溫條件及25 ℃恢復(fù)培養(yǎng)下葉片H2O2的含量;同時(shí)測(cè)定低溫處理下返白系和矮變1號(hào)幼苗葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù),用qRT-PCR分析主要光合電子傳遞體基因以及清除質(zhì)體活性氧相關(guān)酶類(lèi)基因的表達(dá)量;分析返白系和矮變1號(hào)在低溫處理下葉片H2O2的含量是否存在差異,并初步分析導(dǎo)致差異的生理與分子機(jī)制,以期為深入探究ROS與返白系葉色白化的相關(guān)性奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料及處理

    供試材料為冬小麥品種矮變1號(hào)和返白系,種子獲贈(zèng)于陜西省西安市農(nóng)科所李丕皋研究員,由實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存。挑選整齊一致的小麥種子,在室溫下用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng),長(zhǎng)到一葉一心期時(shí)移至4 ℃低溫人工氣候箱中,培養(yǎng)條件:光暗周期16/8 h,有效光量子密度250 μmol·m-2·s-1,相對(duì)濕度70%,持續(xù)低溫培養(yǎng)約90 d至返白系葉片全白,之后移至25 ℃人工氣候箱培養(yǎng)10 d待葉片復(fù)綠。

    1.2 小麥葉片中H2O2含量的檢測(cè)

    選取4 ℃低溫處理0、5、10、20、30和90 d,以及25 ℃復(fù)綠培養(yǎng)2、5和10 d后的小麥倒一展開(kāi)葉,將去除葉尖后剩余的長(zhǎng)約2.5 cm、寬約1 cm的葉片放入DAB染色液(0.1% 二甲基聯(lián)苯胺,0.1% Tween-20,用HCl調(diào)至pH5.6)中,避光染色24 h,之后將葉片放入脫色液(10%冰醋酸,10%丙三醇,用無(wú)水乙醇配制)中,加熱煮沸10 min脫色,4 ℃放置過(guò)夜后在體式顯微鏡下觀察拍照。

    1.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定

    選取小麥幼苗的倒一展開(kāi)葉進(jìn)行測(cè)量。將小麥葉片平放在潤(rùn)濕的濾紙上避光30 min后,立即放進(jìn)葉綠素?zé)晒獬上駜x中進(jìn)行測(cè)量,按照軟件操作指南進(jìn)行相關(guān)參數(shù)設(shè)定:Act1=20,Super=20,Shutter=20,Sensitivity = 40。選取葉片基部,用FluorCam Software 7.0軟件分析小麥葉片的原初光能轉(zhuǎn)化效率Fv/Fm、光化學(xué)淬滅系數(shù)qP的變化,每組處理測(cè)定3~5株小麥。

    1.4 相關(guān)基因表達(dá)量的qRT-PCR檢測(cè)

    根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期基因芯片檢測(cè)數(shù)據(jù),結(jié)合葉綠體基因表達(dá)譜,篩選出返白系與矮變1號(hào)中與光合電子傳遞、活性氧清除相關(guān)且表達(dá)有差異的基因。在GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)和GrainGenes(https://wheat.pw.usda.gov/GG3/)中比對(duì)這些基因,確定序列保守區(qū)域,用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)qRT-PCR引物(表1)。

    表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物Table 1 Primers for qRT-PCR

    以各組處理的小麥幼苗心葉為材料,Trizol法提取心葉總RNA,按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa,日本)說(shuō)明書(shū)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用ddH2O稀釋cDNA樣品至200 ng·μL-1左右,置-80 ℃?zhèn)溆?。使用PrimeScriptTMRT-PCR Kit(TaKaRa,日本),在公司CFX-96型熒光定量PCR儀(Bio-Rad,美國(guó))上以TaARF(ADP-ribosylation factor)基因?yàn)閮?nèi)參基因,檢測(cè)基因的表達(dá)量變化。每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù),根據(jù)Ct值,利用公式2-△△Ct計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 低溫處理與升溫過(guò)程中返白系和矮變1號(hào)小麥葉片H2O2含量的動(dòng)態(tài)變化

    二氨基聯(lián)苯胺(DAB)滲透到植物組織中后可與細(xì)胞中的H2O2迅速反應(yīng),生成紅棕色聯(lián)苯胺腙沉淀,紅棕色程度深淺可以顯示細(xì)胞中H2O2的含量。用DAB染色法,檢測(cè)低溫持續(xù)處理90 d的過(guò)程中,及升溫復(fù)綠10 d過(guò)程中返白系葉片H2O2含量的動(dòng)態(tài)變化,用矮變1號(hào)作為對(duì)照,結(jié)果如圖1、圖2所示。

    圖1顯示,低溫處理前,返白系與矮變1號(hào)幼苗葉片H2O2含量基本一致。4 ℃低溫處理后,短期內(nèi)(5和15 d),矮變1號(hào)葉片H2O2含量無(wú)明顯變化,長(zhǎng)期(30和90 d)低溫處理后矮變1號(hào)葉片的H2O2含量略有增加。與矮變1號(hào)相比,返白系葉片在低溫處理5 d時(shí)顏色就有較明顯加深,隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng),H2O2含量持續(xù)增加,在低溫處理90 d葉片全白時(shí),葉片已呈明顯的紅棕色,H2O2含量達(dá)到最高值。表明低溫脅迫下返白系葉片中H2O2的含量明顯高于矮變1號(hào),持續(xù)低溫引起了返白系葉片中H2O2的大量累積。

    將低溫處理90 d的小麥幼苗移至25 ℃培養(yǎng),可使白化的返白系葉片在短時(shí)間內(nèi)復(fù)綠。由圖2看出,隨著25 ℃培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),小麥葉片的染色逐漸變淺,25 ℃培養(yǎng)下5 d的返白系葉片著色與低溫處理5 d接近, 25 ℃培養(yǎng)10 d后葉片著色與低溫處理前基本一致。說(shuō)明葉片中H2O2的含量隨著溫度的上升迅速下降,直至恢復(fù)到低溫處理前的水平,外界溫度條件調(diào)控了返白系葉片中H2O2的含量。

    2.2 低溫處理下返白系和矮變1號(hào)小麥葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化

    本研究采用了Fv/Fm和qP兩個(gè)葉綠素?zé)晒鈪?shù)來(lái)反映返白系在低溫條件下葉綠體光合電子傳遞能力。Fv/Fm是最大光化學(xué)量子產(chǎn)量,反映PSⅡ反應(yīng)中心內(nèi)有效光化學(xué)量子產(chǎn)量,即原初光能轉(zhuǎn)化效率。逆境脅迫下Fv/Fm明顯下降,是植物抗冷性的主要敏感指標(biāo)。qP是光化學(xué)淬滅系數(shù),表示由光合作用引起的熒光淬滅,反映了PSⅡ的天線色素分子將其所吸收的光能用于光化學(xué)電子傳遞的份額,也可反映PSⅡ原初電子受體QA的還原狀態(tài)。Fv/Fm和qP值的降低會(huì)引起質(zhì)體ROS的累積。

    從圖3可以看出,當(dāng)?shù)蜏靥幚?0 d時(shí),返白系表現(xiàn)出自葉片基部的黃化,對(duì)應(yīng)區(qū)域的Fv/Fm和qP值低于矮變1號(hào)。當(dāng)?shù)蜏靥幚?0 d時(shí),返白系的葉片表現(xiàn)為全白,此時(shí)的Fv/Fm和qP也幾乎檢測(cè)不到。由此可知,低溫脅迫下,返白系葉片的光合電子傳遞效率和光合活性低于矮變1號(hào)。

    A:矮變1號(hào);F:返白系。下圖同。

    圖2 室溫(25 ℃)復(fù)綠過(guò)程中小麥葉片H2O2含量的變化

    2.3 低溫處理下返白系和矮變1號(hào)小麥中與質(zhì)體H2O2累積相關(guān)基因的表達(dá)模式

    對(duì)4個(gè)光合電子傳遞體亞基基因ndhB、ndhK、petD和petN,以及4個(gè)質(zhì)體H2O2清除相關(guān)基因APX4、tAPX、sAPX和HO1進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證,結(jié)果如圖4和圖5所示。

    ndhB和ndhK是NDH復(fù)合體的亞基基因,petD和petN是Cytb6f復(fù)合體亞基基因,這4個(gè)基因都是由葉綠體編碼。由圖4看出,這4個(gè)基因?qū)Φ蜏仨憫?yīng)很敏感,短時(shí)間低溫就可誘導(dǎo)4個(gè)基因的表達(dá)上調(diào),ndhB在低溫2 d表達(dá)量達(dá)到最大值,其他3個(gè)基因的表達(dá)量分別在低溫10 d和20 d 達(dá)到峰值,之后則持續(xù)下調(diào)。溫度回升后,基因表達(dá)量又逐漸上調(diào)。低溫條件下,返白系中4個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量幾乎都顯著低于矮變1號(hào),在低溫處理30 d和90 d葉片全白時(shí),返白系和矮變1號(hào)中4個(gè)基因的表達(dá)水平差異非常明顯,這與圖2中返白系葉片的Fv/Fm和qP值明顯低于矮變1號(hào)相一致,光合電子傳遞體相關(guān)基因的表達(dá)水平低于矮變1號(hào)可能是返白系光合電子傳遞效率降低的部分原因。

    圖5顯示,低溫條件下,4個(gè)基因在返白系中分別表現(xiàn)為先上調(diào)再下調(diào)(APX4、tAPX和HO1) 或上-下-上的變化模式(sAPX)。矮變1號(hào)與返白系基本一致,但APX4基因在持續(xù)低溫90 d時(shí)上調(diào)表達(dá)。說(shuō)明這4個(gè)基因可以對(duì)低溫做出積極的響應(yīng),但每個(gè)基因?qū)Φ蜏氐拿舾谐潭群晚憫?yīng)的模式不同。

    Fv/Fm:最大光化學(xué)量子產(chǎn)量; qP:光化學(xué)淬滅系數(shù)。

    比較兩種材料基因的表達(dá)量后看出,低溫處理前,在兩個(gè)材料間除sAPX基因差異不顯著外,其余3個(gè)基因均表現(xiàn)為返白系中的表達(dá)量顯著高于矮變1號(hào)。返白系中的APX4基因在低溫處理5 d、HO1基因在低溫處理20 d后,相對(duì)表達(dá)量就一直顯著低于矮變1號(hào);至低溫90 d時(shí),除sAPX外的其他3個(gè)基因均是返白系中的表達(dá)量顯著低于矮變1號(hào)。當(dāng)溫度升高至25 ℃后,返白系中除sAPX外的其他3個(gè)基因表達(dá)量均表現(xiàn)為上調(diào),至25 ℃處理10 d時(shí),4個(gè)基因在返白系中的表達(dá)量又都略微或者顯著高于矮變1號(hào)。這些結(jié)果表明,相對(duì)于矮變1號(hào),低溫抑制了返白系中APX4與HO1的表達(dá),返白系中APX4與HO1的低水平表達(dá)減弱了清除質(zhì)體中過(guò)量H2O2的能力,這可能是長(zhǎng)期低溫條件引起返白系中H2O2累積的重要原因之一。

    3 討 論

    低溫會(huì)影響光合器官的結(jié)構(gòu)和活性,影響光合電子傳遞和光合磷酸化過(guò)程[21]。本研究發(fā)現(xiàn),低溫處理下,相較于矮變1號(hào),返白系葉片會(huì)累積大量的H2O2;通過(guò)測(cè)定低溫處理下返白系和矮變1號(hào)葉片中表征光合電子傳遞效率的葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm、qP,發(fā)現(xiàn)隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng),返白系葉片中Fv/Fm、qP值明顯降低,揭示出低溫脅迫下返白系葉片的光合電子傳遞受阻,電子傳遞鏈效率降低,可能會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的電子滲漏,并通過(guò)Mehler反應(yīng)和SOD催化生成大量的H2O2。

    進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),低溫處理下,返白系光合電子傳遞鏈中NDH復(fù)合體的亞基基因ndhB、ndhK以及Cytb6f復(fù)合體亞基基因petD和petN的表達(dá)量都顯著低于矮變1號(hào)。NDH復(fù)合體和Cytb6f復(fù)合體是葉綠體中光合電子傳遞鏈中必不可少的組分和反應(yīng)場(chǎng)所[22],返白系中ndhB、ndhK、petD和petN較低的表達(dá)水平可能是低溫處理下返白系中光合電子傳遞的效率明顯低于矮變1號(hào)的重要原因,導(dǎo)致電子由PS中心流向NADP的途徑受阻,產(chǎn)生電子泄露,并最終生成H2O2。

    A:矮變1號(hào);F:返白系。*和**分別表示在相同處理?xiàng)l件下返白系與矮變1號(hào)之間差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。下圖同。

    細(xì)胞中活性氧的濃度是由產(chǎn)生和清除兩種途徑控制的[10]。本研究對(duì)低溫處理下返白系和矮變1號(hào)中質(zhì)體H2O2清除相關(guān)基因APX4、tAPX、sAPX和HO1的qRT-PCR結(jié)果表明,在低溫處理下,返白系中APX4和HO1的表達(dá)水平顯著低于矮變1號(hào)。APX4和HO1在清除質(zhì)體過(guò)量的H2O2上發(fā)揮著重要作用,其中APX是一種亞鐵血紅素蛋白,它以抗壞血酸為電子供體將H2O2分解為水,APX4可以與血紅素結(jié)合, 具有抗氧化活性,能夠清除葉綠體中的ROS[12]。過(guò)表達(dá)chlAPX和HO可以增強(qiáng)植物的抗氧化脅迫和抗逆性[14,23]。低溫處理下返白系質(zhì)體中APX4和HO1相對(duì)較低的表達(dá)量意味著低溫處理下返白系質(zhì)體(特別是基粒類(lèi)囊體)中大量積累的H2O2不能得到有效清除,使得返白系質(zhì)體中H2O2維持在較高的水平。一方面,低溫處理下返白系中由于光合電子傳遞受阻,電子泄露,最終反應(yīng)生成大量H2O2;另一方面,低溫處理下,返白系中清除質(zhì)體H2O2的關(guān)鍵酶APX4和HO1的表達(dá)水平較低,質(zhì)體H2O2清除能力減弱,共同作用下導(dǎo)致了低溫處理下返白系葉片中H2O2的大量累積。低溫處理下返白系葉片累積的H2O2可能與低溫誘導(dǎo)白化現(xiàn)象存在相關(guān)性,其對(duì)葉色白化的影響還有待于深入研究。

    圖5 質(zhì)體H2O2清除相關(guān)基因表達(dá)分析

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