超高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)法測(cè)定雙孢菇中噻蟲嗪及其代謝物噻蟲胺殘留量

朱衛(wèi)芳 ，馬 琳 ，陳建波 ，趙 莉 *，占繡萍

（1.上海市青浦區(qū)食用農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)中心，上海 201799；2.上海市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，上海 201103）

雙孢菇外表白嫩圓潤(rùn)，味道鮮美，受到廣大消費(fèi)者喜愛，是我國(guó)乃至全球食用菌生產(chǎn)中最大的菇種之一。近年來，雙孢菇市場(chǎng)行情看好，各地栽培面積不斷擴(kuò)大，但線蟲等地下害蟲造成的危害也在逐年加重。線蟲主要生活在覆土層，以刺吸菌絲體造成菌絲衰敗，幼菇受線蟲侵害后，菌絲體變得稀疏，培養(yǎng)料下沉、變黑，發(fā)黏發(fā)臭，菌絲消失而不出菇，最終萎縮死亡。實(shí)地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不少種植戶使用噻蟲嗪、吡蟲啉等新煙堿類殺蟲劑防治土壤害蟲，但截至目前，尚未批準(zhǔn)噻蟲嗪在土壤方面的登記使用。種植戶的超范圍使用對(duì)雙孢菇的質(zhì)量安全造成潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)。

研究表明，噻蟲嗪（thiamethoxam）在植物體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為噻蟲胺（clothianidin），因此JMPR評(píng)估報(bào)告中噻蟲嗪的膳食評(píng)估殘留物包括噻蟲嗪和噻蟲胺[1]。噻蟲嗪和噻蟲胺結(jié)構(gòu)式見圖1。噻蟲嗪及其代謝物噻蟲胺的殘留測(cè)定方法主要有HPLC法[2]和LC-MS/MS法[3-5]。前處理方法大多采用固相萃取法（SPE）或QuEChERS方法。目前尚未見同時(shí)檢測(cè)雙孢菇中噻蟲嗪、噻蟲胺的方法報(bào)道。因此，研究建立高效準(zhǔn)確，同時(shí)測(cè)定噻蟲嗪及其代謝物噻蟲胺的農(nóng)殘檢測(cè)方法，對(duì)于保障食品安全，進(jìn)行農(nóng)藥安全評(píng)價(jià)具有重要意義。

圖1 噻蟲嗪（A）及噻蟲胺（B）的結(jié)構(gòu)式

本研究采用改進(jìn)的QuEChERS法，通過對(duì)樣品量和凈化條件等進(jìn)行優(yōu)化，并結(jié)合UPLC-MS/MS技術(shù)，建立雙孢菇中噻蟲嗪和噻蟲胺殘留的快速測(cè)定方法。本方法操作簡(jiǎn)單，能夠滿足雙孢菇中噻蟲嗪和噻蟲胺殘留的快速檢測(cè)要求。

1 材料與方法

1.1 儀器等實(shí)驗(yàn)材料

1290超高效液相色譜、G6460三重四極桿質(zhì)譜儀，美國(guó)Agilent公司；Milli-Q超純水儀，美國(guó)Millipore公司；水浴恒溫振蕩器SHA-C，常州國(guó)華電器有限公司。

噻蟲嗪（99.0%）、噻蟲胺（99.0%）標(biāo)準(zhǔn)品，均購(gòu)于德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇（色譜純），德國(guó)Merck公司；PSA、C18，美國(guó)Agilent公司；氯化鈉、無水硫酸鎂（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲酸（分析純），重慶川東化工有限公司。

雙孢菇、香菇樣品購(gòu)于當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 儀器條件

色譜條件：色譜柱為Agilent Proshell 120 EC-C18柱（100 mm×3.0 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相為乙腈＋0.1%甲酸水溶液（體積比95∶5）；流速為0.4 mL/min；柱溫為40℃；進(jìn)樣量為2 μL。外標(biāo)法（峰面積）定量。

質(zhì)譜條件：ESI源正離子模式電離，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；氣體溫度：300℃；氣體流量：7 L/min；霧化器壓力：275.8 kPa；鞘氣溫度：350℃；鞘氣流量：11 L/min。

1.2.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5.0 g（精確至0.1 g）樣品至50 mL離心管中，加入5 mL乙腈，冰浴超聲提取20 min，再加入2.0 g NaCl，渦旋1 min，并以3 000 r/min離心5 min。取2 mL上清液轉(zhuǎn)入至裝有0.3 g無水硫酸鎂、50 mg PSA和40 mg C18的15 mL離心管中，渦旋1 min，并以3 000 r/min離心5 min。取上清液過0.22 μm濾膜，制成待測(cè)液。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

配制2種農(nóng)藥標(biāo)樣溶液（0.1 mg/L），并移取2 μL，以乙腈＋水（體積比50∶50）為流動(dòng)相，采用電噴霧正負(fù)離子模式，對(duì)各農(nóng)藥進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描，確定農(nóng)藥的母離子。對(duì)各個(gè)農(nóng)藥的母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，確定各農(nóng)藥的子離子。最后結(jié)合基質(zhì)空白和基質(zhì)標(biāo)樣溶液的離子掃描圖，進(jìn)一步優(yōu)化參數(shù)，確定2種農(nóng)藥在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式下的質(zhì)譜采集參數(shù)及質(zhì)譜條件，結(jié)果見表1。圖2為0.1 mg/L雙孢菇基質(zhì)標(biāo)樣溶液的MRM離子色譜圖。

表1 2種農(nóng)藥的LC-MS/MS檢測(cè)條件參數(shù)

圖2 2種農(nóng)藥的UPLC-MS/MS色譜圖

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 稱樣量

QuEChERS方法中的稱樣量一般為10.0 g[6]。本實(shí)驗(yàn)考察不同稱樣量（3.0、5.0、10.0 g）對(duì)2種農(nóng)藥回收率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。結(jié)果表明，樣品稱樣量過少或過多均會(huì)影響回收率。當(dāng)稱樣量為5.0 g時(shí)，2種農(nóng)藥的回收率均最佳。且隨著稱樣量的增加，溶劑等消耗增加，成本也會(huì)上升，因此，本實(shí)驗(yàn)選取的最佳稱樣量為5.0 g。

表2 C18用量對(duì)回收率的影響

2.2.2 吸附劑選擇

PSA是QuEChERS法理想的凈化吸附劑。25 mg PSA可以完全吸附1 g含水量較高的水果、蔬菜提取液中的有機(jī)酸、糖類、極性色素等干擾物質(zhì)，且對(duì)目標(biāo)農(nóng)藥的回收率影響可以忽略不計(jì)[7]。參考AOAC 2007.01方法，本研究中每mL提取液用25 mg PSA進(jìn)行凈化吸附。

在凈化方法研究中，為了更好地去除樣品中的蠟質(zhì)、甾醇、維生素等雜質(zhì)，在添加25 mg PSA的同時(shí)添加不同用量C18（0、10、20、50、80和100 mg），研究結(jié)果見圖3。C18的加入能夠明顯降低蠟質(zhì)、甾醇、維生素等雜質(zhì)的干擾。當(dāng)C18用量為20 mg時(shí)，2種農(nóng)藥的回收率均較高，且用量繼續(xù)增加，2種農(nóng)藥的回收率變化不明顯。因此，本實(shí)驗(yàn)確定每mL提取液加入25 mg PSA和20 mg C18凈化劑。

圖3 不同C18用量對(duì)雙孢菇中2種農(nóng)藥回收率的影響

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是由共洗脫基質(zhì)組分引起的分析信號(hào)抑制或增強(qiáng)現(xiàn)象，已被廣泛研究并被認(rèn)為是食品樣品LC-MS/MS定量分析中的誤差源[8-9]。本研究使用基質(zhì)匹配的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物來補(bǔ)償基質(zhì)溶液中目標(biāo)農(nóng)藥的基質(zhì)效應(yīng)（Mi）。

Mi為正值，基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)，反之減弱。當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)增強(qiáng)或抑制超過20%，則認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量檢測(cè)具有顯著影響，不可忽略[9]。雙孢菇中噻蟲嗪和噻蟲胺的基質(zhì)效應(yīng)分別為-25%和-31%，減弱效應(yīng)比較明顯，均超過20%。為確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液為基準(zhǔn)進(jìn)行校正。

2.4 方法評(píng)價(jià)

2.4.1 線性關(guān)系與檢出限

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)2種目標(biāo)農(nóng)藥的混合標(biāo)樣溶液進(jìn)行UPLC-MS/MS測(cè)定。以各農(nóng)藥的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算得到線性方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表3。噻蟲嗪、噻蟲胺質(zhì)量濃度為0.005～0.5 mg/L時(shí)，方法線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)分別為0.998 3、0.996 1。當(dāng)實(shí)際樣品中2種農(nóng)藥殘留量超過此線性范圍時(shí)，應(yīng)對(duì)樣品溶液適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行定量測(cè)定。在信噪比（S/N）為3時(shí)，2種農(nóng)藥的檢出限（LOD）均為0.1 ng。

表3 方法的線性范圍及線性方程

2.4.2 回收率與精密度

分別在空白雙孢菇樣品中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.005、0.01、0.5 mg/kg的混標(biāo)溶液，每個(gè)添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)平行測(cè)定5次，進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表4。2種農(nóng)藥的平均回收率為85%～112%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.5%～7.1%。以最低加標(biāo)濃度可知，2種農(nóng)藥的定量限（LOQ）為0.005 mg/kg。結(jié)果表明，本方法具有較高的回收率和精密度，滿足農(nóng)藥多殘留檢測(cè)要求。

表4 2種農(nóng)藥的平均加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）

2.4.3 方法應(yīng)用

采用本文建立方法，對(duì)50份市售雙孢菇和香菇進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，1份雙孢菇中檢出噻蟲嗪，4份雙孢菇中檢出噻蟲胺，3份香菇中檢出噻蟲胺，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01～0.025 mg/kg，超過歐盟在栽培食用菌上的MRL值（0.01 mg/kg）。因此，食用菌中噻蟲嗪及其代謝物噻蟲胺殘留污染問題須引起監(jiān)管部門的高度注意，防止發(fā)生因農(nóng)藥殘留污染引起食品安全和環(huán)境污染問題。

3 小結(jié)

本研究采用優(yōu)化的QuEChERS方法，結(jié)合UPLCMS/MS技術(shù)，建立了雙孢菇中噻蟲嗪及其代謝物噻蟲胺殘留的快速測(cè)定方法。方法操作簡(jiǎn)單，其靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度均符合殘留測(cè)定要求，并能很好地消除干擾。此外，樣品的前處理簡(jiǎn)便易行，極大地縮短了檢測(cè)時(shí)間，減少了有機(jī)溶劑使用量，便于實(shí)際操作。