一株青刺果內(nèi)生真菌的分離鑒定及抑菌試驗(yàn)

楊嫦麗，鄭 鵬

(麗江師范高等專科學(xué)校，云南麗江 674100)

內(nèi)生菌(endophyte)指的是一類其生活史的一定階段或全部階段生活在健康植物體內(nèi)的，但對宿主植物不會引起明顯的病害癥狀的微生物[1]，普遍存在于植物各種組織中。最早在1993年由Stierle從紅豆杉中分離到一株能產(chǎn)生紫杉醇的內(nèi)生真菌，并發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌可以產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的活性成分[2]，此后，植物內(nèi)生菌的研究在國內(nèi)外掀起熱潮，特別對藥用植物內(nèi)生菌的研究成為一大熱點(diǎn)，據(jù)統(tǒng)計，已經(jīng)開展內(nèi)生菌研究的藥用植物有40多科100多種[3]，對藥用植物內(nèi)生菌應(yīng)用的分析和開發(fā)提出了可能性。大量研究表明，植物內(nèi)生菌除了能產(chǎn)生與宿主植物相同功能的生物活性之外，某些藥用植物的內(nèi)生菌還能夠獨(dú)立產(chǎn)生如抗生素之類的豐富次級代謝產(chǎn)物[4]。植物內(nèi)生菌種類較多，包括內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生真菌、內(nèi)生放線菌，其生物學(xué)功能也比較豐富。內(nèi)生菌與宿主植物協(xié)同進(jìn)化，通常與宿主的生物學(xué)功能有一定的關(guān)聯(lián)[5]，所以植物內(nèi)生菌的研究對其宿主植物的選擇也尤其重要。

青刺果(PrinsepiautilisRoyle)，為薔薇科扁核木屬(Pdnsepia)多年生的一種常綠灌木[6]，在我國主要分布于高原地區(qū)，在麗江主要分布于海拔2 300～3 200 m的高寒冷涼山區(qū)；用途廣泛，全身具有較高的營養(yǎng)和藥用價值，其莖、葉、果、根均可入藥，在云南，少數(shù)民族具有上千年的民間藥用、食用歷史。青刺果中分離的化合物具有動物紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞免疫功能，能提高機(jī)體免疫以及降血糖和降血脂[6-7]，其提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、志賀菌和白色念珠菌等細(xì)菌、真菌具有較好的抑菌效果[8-13]。目前國內(nèi)外對青刺果的化學(xué)成分和營養(yǎng)價值研究較廣泛，但對青刺果內(nèi)生菌的研究報道較少[14]。筆者從青刺果中分離得到內(nèi)生真菌3B-S，對其進(jìn)行分類鑒定和抑菌檢測試驗(yàn)，初步研究3B-S的抗菌作用，為后期青刺果與內(nèi)生菌活性成分的研究以及植物內(nèi)生菌的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1供試材料供試青刺果(PrinsepiautilisRoyle)采自麗江金山鄉(xiāng)新團(tuán)片區(qū)田間。供試菌株膠胞炭疽病菌和尖孢鐮刀菌古巴?；筒【鸀辂惤瓗煼陡叩葘？茖W(xué)校生物實(shí)驗(yàn)室保藏。培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1內(nèi)生真菌3B-S的分離。取青刺果健康莖段表面沖洗干凈，晾干后蒸餾水沖洗3次，切成3 cm左右的小段浸泡于75%乙醇中30 s，再用無菌水沖洗數(shù)次，無菌濾紙吸干水分，切掉小莖段兩端露出新組織，再切成兩半接種于PDA平板，28 ℃暗培養(yǎng)14 d。待植物組織上有菌絲長出后，挑取菌絲于PDA培養(yǎng)基平板劃線分離純化，保存單菌落備用。

1.2.2內(nèi)生真菌3B-S的鑒定。

1.2.2.1菌落特征觀察。用滅菌的打孔器對保存好的菌落進(jìn)行打孔，菌餅放置于PDA培養(yǎng)基平板中央，于28 ℃培養(yǎng)7 d并觀察菌落特征。

1.2.2.2形態(tài)特征觀察。取打孔后的菌餅置于PDA平板中央，用插片法，用滅菌后的鑷子將4塊無菌蓋玻片豎直插入菌餅四周，于28 ℃培養(yǎng)，待菌絲長到蓋玻片上后，輕取出，用火焰稍加熱固定后棉蘭染色液染后，加工做成裝片，于光學(xué)顯微鏡下觀察形態(tài)。

1.2.3內(nèi)生真菌3B-S抑菌檢測。備好用平板培養(yǎng)基培養(yǎng)好的膠胞炭疽病菌和尖孢鐮刀菌古巴?；筒【?、3B-S菌落，用滅過菌的打孔器分別對3B-S和2個病原菌進(jìn)行打孔。取3B-S菌餅接種到PDA平板培養(yǎng)基中央，尖孢鐮刀菌古巴專化型病菌菌餅接種于3B-S菌餅左邊，膠胞炭疽病菌餅接種在右邊，放于28 ℃恒溫中培養(yǎng)7 d進(jìn)行對峙檢測，觀察抑菌情況。3個菌餅距離2 cm左右。

2 結(jié)果與分析

2.13B-S的分離和形態(tài)特征從青刺果莖段中成功分離得到內(nèi)生真菌3B-S，純化培養(yǎng)成菌落，從圖1可觀察發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌3B-S菌株呈絲狀，菌落最初灰白色，隨著培養(yǎng)時間逐漸長成黑色。菌絲體在平板上埋生或氣生，由菌餅向四周均勻生長，生長迅速，背面黑色。菌絲光滑，有隔多分支，分生孢子梗單身，分生孢子梗頂端膨大為瓶狀(圖2)。分生孢子單身，剛形成時半透明，成熟的分生孢子黑色，球形或扁球形。根據(jù)青刺果內(nèi)生真菌3B-S的形態(tài)學(xué)特征，參照真菌分類鑒定方法、參考張敬澤等[15]研究，初步確定該菌為黑孢菌屬真菌。

圖1 菌株3B-S 菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of strain 3B-S

圖2 3B-S菌絲和分生孢子形態(tài)Fig.2 Mycelium and conidia morphology of 3B-S

2.2內(nèi)生真菌3B-S的初步抑菌監(jiān)測內(nèi)生真菌3B-S與膠胞炭疽病菌和尖孢鐮刀菌古巴?；筒【膶χ排囵B(yǎng)發(fā)現(xiàn)(圖3)，經(jīng)過7 d培養(yǎng)后，內(nèi)生真菌3B-S迅速生長，而膠胞炭疽病菌和尖孢鐮刀菌古巴?；筒【纳L均受到3B-S的抑制，逐漸被內(nèi)生真菌3B-S菌絲覆蓋，有較明顯的抑菌效果，其中對膠胞炭疽病菌的抑制效果更為明顯。

圖3 內(nèi)生真菌3B-S對尖孢鐮刀菌(區(qū)域A)和炭疽病菌(區(qū)域B)的對峙檢測Fig.3 Detection of endophytic bacteria 3B-S against Fusarium oxysporum(region A)and anthracnose(region B)

3 討論

隨著化學(xué)合成的部分農(nóng)藥、化肥、醫(yī)藥等對人類賴以生存的生態(tài)環(huán)境和自身飲食健康產(chǎn)生不同程度的負(fù)面影響，人們對生活的需求越來越重視，探索新興的、生態(tài)綠色的代替品成為人類的重要目標(biāo)。而植物內(nèi)生菌被發(fā)現(xiàn)具有獨(dú)特的遺傳代謝，不僅對植物生長發(fā)育、植物抗逆性有重要的影響，還能產(chǎn)生抗菌、抗病毒、抗腫瘤等生物活性物質(zhì)。因此，分離鑒定植物的內(nèi)生菌，研究植物內(nèi)生菌的抗菌活性和拮抗作用，在生物防治、醫(yī)藥研究、土壤改善等方面具有重要的意義和廣闊的前景。

該研究通過對內(nèi)生菌形態(tài)特征觀察，從形態(tài)學(xué)上初步鑒定3B-S為黑孢菌屬真菌，但較系統(tǒng)的分類鑒定還需借助分子技術(shù)進(jìn)一步的rDNA系列測定及系統(tǒng)進(jìn)化分析。目前，黑孢菌屬被報道的種較為鮮見，該試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的黑孢菌屬的分類鑒定和相關(guān)研究具有重要的意義。

抑菌檢測試驗(yàn)中，青刺果內(nèi)生真菌3B-S對膠胞炭疽病菌和尖孢鐮刀菌古巴?；筒【忻黠@的抑菌效果，說明內(nèi)生真菌3B-S在抑菌研究方面具有一定的研究價值。青刺果本身的藥用價值有較大的開發(fā)潛力，前期已有大量研究證明青刺果化合物具有抗癌、抑菌等效果，而植物內(nèi)生菌與宿主植物的生物學(xué)功能有關(guān)聯(lián)，因此研究青刺果內(nèi)生菌具有開發(fā)和應(yīng)用價值，但對植物病菌的抑制作用還需要大量的檢測，對內(nèi)生菌的活性物質(zhì)及與青刺果植物活性成分的關(guān)聯(lián)性還需進(jìn)一步分析。