小鼠骨髓細(xì)胞有絲分裂染色體標(biāo)本制備方法的優(yōu)化

高振華，吳浩浩，趙志輝，許英梅，Aguzey Harry，程貴蘭，生 冉，許嫣紅

(廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東湛江 524088)

細(xì)胞染色體是細(xì)胞核中穩(wěn)定且重要的成分，是生物遺傳物質(zhì)的載體，其數(shù)目與形態(tài)是研究生物進(jìn)化、遺傳變異、個(gè)體發(fā)育、疾病預(yù)防、病因發(fā)生、疾病診斷和治療等的基礎(chǔ)手段[1-3]。染色體標(biāo)本的制備是進(jìn)行染色體核型分析、帶型分析和檢測(cè)遺傳學(xué)相關(guān)疾病的前提[4-7]。小鼠因其繁殖周期短、產(chǎn)仔數(shù)多、成熟早、個(gè)體小、易操作、成本低且與人類基因相似度高等特點(diǎn)[8-10]，是人類疾病研究的首選動(dòng)物模型，骨髓細(xì)胞因數(shù)量多、取材方便、分裂增殖性強(qiáng)、不需要進(jìn)行無(wú)菌操作和體外培養(yǎng)，方法簡(jiǎn)捷而成為進(jìn)行染色體標(biāo)本制備的理想材料[11-13]，也是各高校用于細(xì)胞遺傳類教學(xué)的首選實(shí)驗(yàn)方法。僅從低滲處理步驟開(kāi)始至染色前，所需要的時(shí)間大約140 min，耗時(shí)長(zhǎng)，從而導(dǎo)致學(xué)生實(shí)驗(yàn)不好安排，人們也在嘗試優(yōu)化和改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法，以減少實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間，但以前的研究大多集中于取樣部位的選取、離心條件改變、低滲溶液濃度改變、固定液濃度改變等[14-17]，固定次數(shù)和固定時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)時(shí)間的影響研究鮮見(jiàn)報(bào)道。為此，筆者對(duì)制片操作過(guò)程中的固定環(huán)節(jié)進(jìn)行了適當(dāng)優(yōu)化，以縮短操作時(shí)間。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇4～8周齡小鼠，性別不限。

1.2器材與試劑

1.2.1器材。解剖板、解剖剪、大小鑷子、吸管、離心管、培養(yǎng)皿、預(yù)冷載玻片、酒精燈、擦鏡紙、恒溫水浴箱、TDL-5 型離心機(jī)。

1.2.2試劑。秋水仙素200 μg/mL、2%檸檬酸鈉溶液、0.075 mol/L KCl 低滲溶液、甲醇乙酸(3∶1)固定液、Giemsa 染液。

1.3方法

1.3.1預(yù)處理。在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，共選取4～8周齡的健康小鼠201只，公母不限，隨機(jī)分為3組，分別1次固定38只(60 min)、2次固定123只(30、25 min))和3次固定41只(30、25、15 min)，其他操作步驟不變。具體操作步驟按照《動(dòng)物遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》[18]進(jìn)行。

1.3.2實(shí)驗(yàn)程序。①注射秋水仙素：在試驗(yàn)開(kāi)始前3～4 h 給小鼠腹腔注射秋水仙素，注射劑量為每只小鼠注射200 μg/mL的秋水仙素0.4 mL。②處死小鼠，收集骨髓細(xì)胞：采用頸部移位法處死小鼠，后腿中間剪開(kāi)皮膚和肌肉，從后肢根部取出股骨置于培養(yǎng)皿中，分離去除附在骨上的肌肉。用2%檸檬酸鈉清洗干凈，剪掉股骨兩端股骨頭，暴露骨髓腔，用注射器吸取2%的檸檬酸鈉5 mL，反復(fù)沖洗骨髓腔至股骨變白，將沖洗液置于離心管中離心，去除上清液留沉淀。③低滲處理：在細(xì)胞懸液中加入5 mL 0.075 mol/L的 KCl溶液6 mL，將細(xì)胞吹打1次，在37 ℃下水浴30 min，中間吹打1次；1 000 r/min離心10 min。④固定：加入3∶1的甲醇-冰醋酸固定液進(jìn)行固定，具體方法包括1次固定(60 min)、2次固定(30、25 min)和3次固定(30、25、15 min)。最后一次固定后離心，棄去上清液，加入3∶1的甲醇-冰醋酸固定液2～3滴(視細(xì)胞數(shù)量適當(dāng)增減，大約相當(dāng)于 5倍細(xì)胞的體積)，搖勻制成細(xì)胞懸液。⑤滴片：取事先預(yù)冷(-20 ℃)的載玻片，迅速?gòu)募s30 cm 高處滴加細(xì)胞懸液1～2 滴，輕輕吹散，酒精燈上過(guò)火2～3次(切勿過(guò)熱烤干)，風(fēng)干。⑥染色：取風(fēng)干后的薄片置于玻璃板上，滴滿Gimesa染液(0.5 mL Gimesa原液加入9.5 mL 0.01 mol/L PBS，pH 6.8)于載玻片上，染色30 min后用蒸餾水沖洗，晾干后觀察。

1.4數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著；采用Duncan’s多重比較進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

對(duì)固定環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化，分為3種固定方法，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同固定方法的效果比較

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P< 0.05)

Note：Different small letters in the same column indicated significant differences(P< 0.05)

1次固定染色體制片成功率為75.00%，制片效果不佳，染色體不清晰，重疊，排列不整齊，過(guò)于分散不集中；2次固定染色體制片成功率為82.10%，染色體數(shù)目清楚，結(jié)構(gòu)清晰，分散充分而適度，沒(méi)有疊加；3次固定染色體制片成功率為82.90%，染色體長(zhǎng)度適中，數(shù)目分明，染色體形態(tài)可見(jiàn)，整齊排列不疊加。從制片成功率和和染色體標(biāo)本制備的質(zhì)量來(lái)看，2次固定和3次固定的效果均好于1次固定，且2次固定和3次固定的效果差異不明顯(P<0.05)。3種固定方法的視野中骨髓細(xì)胞數(shù)量差異不顯著。染色體中期分裂相細(xì)胞數(shù)量的變化與視野中骨髓細(xì)胞數(shù)量相一致，多次固定的效果也顯著優(yōu)于1次固定(P<0.05)。

3 討論

小鼠骨髓細(xì)胞的染色體制備是細(xì)胞遺傳學(xué)、細(xì)胞工程類課程的基本實(shí)驗(yàn)方法，用于染色體結(jié)構(gòu)和功能分析及操作，從秋水仙素的注射、骨髓細(xì)胞的獲取以及低滲處理、固定及滴片的環(huán)節(jié)都要求精細(xì)操作，但固定操作環(huán)節(jié)耗時(shí)最長(zhǎng)，一般教材提供的方法大多是3次固定，固定時(shí)間分別為30、25和15 min，在每次固定后需要離心10 min，僅固定環(huán)節(jié)就耗時(shí)100 min。因此，基于HACCP(危害分析與關(guān)鍵點(diǎn)控制)理論分析，固定次數(shù)和固定時(shí)間是制約整個(gè)實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵因素，直接影響實(shí)驗(yàn)所用時(shí)間的長(zhǎng)短，也是實(shí)驗(yàn)程序優(yōu)化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此在多次預(yù)實(shí)驗(yàn)后確定可行的3個(gè)固定程序。該研究發(fā)現(xiàn)，1次固定效果不佳，染色體形態(tài)模糊不清，染色體易離散不集中，染色體邊緣起毛等現(xiàn)象導(dǎo)致觀察效果不佳，不適用于染色體核型分析。研究表明，無(wú)論是小鼠骨髓細(xì)胞、蟾蜍骨髓細(xì)胞等動(dòng)物的同一部位染色體制備，還是小鼠不同部位的細(xì)胞，大多采用2次固定或3次固定。這可能是因?yàn)?次固定甲醇-冰醋酸固定液未能充分透過(guò)細(xì)胞膜發(fā)揮作用，影響制備效果。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，采用2次固定和3次固定時(shí)，標(biāo)本均著絲點(diǎn)位置清晰，染色體明顯伸展、不纏繞，排列整齊，形態(tài)清楚可見(jiàn)。制備麻雀、鵪鶉骨髓細(xì)胞和羊水細(xì)胞的染色體標(biāo)本[14-17]等采用了2次固定，而用3次固定制備小鼠雄性生殖細(xì)胞染色體標(biāo)本[18]也能獲得清晰的染色體樣本，說(shuō)明2種固定方法在試驗(yàn)操作中均獲得較理想的效果。究其原因，這可能是因?yàn)槎啻喂潭墒构潭ㄒ号c細(xì)胞充分混勻并進(jìn)入細(xì)胞，對(duì)染色體起到固定作用，防止染色體蛋白質(zhì)自溶，并能增強(qiáng)染色體的嗜堿性，使染色體形態(tài)清晰，能夠很好地分散[19-22]，提高染色體結(jié)構(gòu)的可見(jiàn)度，改善對(duì)小鼠骨髓染色體核型分析的觀察效果。然而，從操作時(shí)間來(lái)看，2次固定用時(shí)75 min，比3次固定所需時(shí)間(100 min)減少了25 min，節(jié)省了時(shí)間，便于課堂的實(shí)驗(yàn)安排。從節(jié)約時(shí)間、提高效率、節(jié)省人力等綜合因素考慮，制備小鼠骨髓細(xì)胞有絲分裂染色體標(biāo)本的最佳固定方法為2次固定。

固定的目的在于盡快使細(xì)胞的結(jié)構(gòu)固定于接近存活的狀態(tài)，以便進(jìn)行下一步處理，防止細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分解導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變化。冰醋酸滲透力強(qiáng)，固定迅速，可阻止染色體收縮，使染色體結(jié)構(gòu)免于破壞，但易使組織膨脹。甲醇能迅速穿透組織使組織收縮，2種溶液按一定比例混合，既能保證固定效果，又能保證染色體的鋪展。但若固定時(shí)間太長(zhǎng)，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞破裂、染色體片段的過(guò)分膨脹及染色體散失。這也是一次長(zhǎng)時(shí)間固定的觀察中細(xì)胞總數(shù)和分裂相細(xì)胞少的原因。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序是一個(gè)不斷完善的過(guò)程，在進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)多個(gè)步驟尚有待進(jìn)一步優(yōu)化與探索。

4 結(jié)論

小鼠骨髓細(xì)胞有絲分裂染色體標(biāo)本制片可采用2次固定的方法，固定時(shí)間分別為30、25 min。