大花鐵線蓮花芽分化研究

熊陽陽，和文志，于文劍，高鵬華，王 錦*

(1.西南林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224)

被譽為“攀援植物皇后”的鐵線蓮隸屬毛茛科(Ranunculaceae)鐵線蓮屬(Clematis)，多為落葉木質(zhì)藤本?；▋尚曰騿涡裕M成聚傘花序或單生；萼片花瓣狀，著色豐富；無花瓣；雄蕊多數(shù)，心皮多數(shù)。大花鐵線蓮品種因其花型大而多樣、萼瓣顏色豐富等特點應(yīng)用極為廣泛，其通常為單被花，萼瓣5～8枚；也有一些為重被或半重被品種，只有極少數(shù)完全重被。大花鐵線蓮品種分為早花組和晚花組，早花品種花期2次，萼瓣上有清晰脈紋，第1個主花期的花朵開放于頭年老枝，花芽在秋季霜凍前就已經(jīng)完成，春季到來腋芽處會長出新的枝條。晚花品種花開放在當(dāng)年新枝上，花量充沛，但萼瓣上無清晰脈紋[1]。【研究意義】大花鐵線蓮重被品種具有重要的觀賞園藝地位和研究價值。重瓣型栽培品種的研究工作對今后植物品種的應(yīng)用推廣具有現(xiàn)實意義，而重被大花鐵線蓮品種花形多樣，部分品種在不同季節(jié)表現(xiàn)為重被與單被的特性為探究重被花的形成機制提供了很好的研究素材。【前人研究進展】目前關(guān)于大花鐵線蓮重被品種的研究僅有栽培技術(shù)[2-3]及組織培養(yǎng)[4-6]等方面的報道，大花鐵線蓮花器官發(fā)育的研究也限于單被品種[7-8]?！颈狙芯壳腥朦c】以3種花被類型(單被、重被、完全重被)的大花鐵線蓮品種為試材，采用常規(guī)石蠟切片法和顯微技術(shù)對其花芽分化過程進行觀察分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】初步闡明大花鐵線蓮重被花的起源方式，為研究鐵線蓮重被花形成機制奠定形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為西南林業(yè)大學(xué)鐵線蓮種質(zhì)資源圃內(nèi)3種花被類型(單被、重被、完全重被)的大花鐵線蓮品種“朱卡”(C.‘Julka’)，“薇安”(C.‘Vyvyan Pennell’)、“藍光”(C.‘Blue Light’)。試驗觀測時間2017年3-10月，每隔6 d取材1次，隨機采取頂芽或上節(jié)位葉腋處的花芽數(shù)個。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品固定與保存 將所采花芽放入50 % FAA中固定，抽氣2 h后置于室溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 脫水 采用酒精梯度濃度法脫水。具體程序為：70 %乙醇→85 %乙醇→95 %乙醇→叔丁醇→叔丁醇，各梯度脫水時間間隔30 min。

1.2.3 浸蠟與包埋 材料脫水完成后重新加入叔丁醇與碎蠟(1∶1)放入60 ℃恒溫箱過夜。第2天傾去原蠟液后倒入純蠟液，共換2次，每次間隔1 h。待牛皮紙盒底部蠟略凝時將材料切面朝下填入。

1.2.4 切片與粘片 修整蠟塊，用KD-3358 切片機切片，厚度為8 μm。將粘有切好的蠟帶的載玻片放入40 ℃的展片臺上。玻片自然風(fēng)干5～7 d。

1.2.5 脫蠟與染色 將晾好的切片依次放入二甲苯→酒精→二甲苯中進行脫蠟，每次5 min。番紅過夜，固綠30 s。

1.2.6 封片 切片取出后用中性樹膠封固，待3～5 d后顯微鏡觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 開花生物學(xué)特性觀察

從花的構(gòu)造來看，鐵線蓮與其他植物最主要的區(qū)別在于它的‘花’不是由花瓣組成，而是萼片瓣化構(gòu)成了花的形態(tài)。嚴(yán)格意義上講，鐵線蓮是沒有花瓣的，植物學(xué)家們將這種花瓣狀的萼片稱為“萼瓣”[1]。由于萼瓣數(shù)的不同，鐵線蓮的花顯現(xiàn)出單瓣、半重瓣及重瓣3種不同的形態(tài)。本次研究選用鐵線蓮不同花瓣類型的代表品種作為供試材料，為研究鐵線蓮重被花的形態(tài)發(fā)育提供更加嚴(yán)謹(jǐn)?shù)睦碚撘罁?jù)。

薇安(C.‘Vyvyan Pennell’)為早花大花型品種。高2.5～3 m，花深藍紫色，花蕊白色，花藥米黃色多數(shù)，花徑18～22 cm。葉長約8 cm，寬5 cm，花梗長約6 cm。花期2次，晚春重瓣或半重瓣花開于老枝上，萼瓣數(shù)多可達70枚；早秋單被花開于當(dāng)年新枝，萼瓣數(shù)6～9枚。據(jù)花期觀測記錄初花日期在3月20日，終花期在9月25日前后。

藍光(C.‘Blue Light’)為早花大花型重被品種。高2～2.5 m，花中央雌雄蕊都完全瓣化，形成蓮座狀的完全重被花，花色淺藍，花蕊米黃色，萼瓣多數(shù)，花徑10～14 cm，葉長約5 cm，寬3 cm，花梗長約6 cm?；ㄆ?次，老枝新枝均開重被花。初花日期約在3月5日，終花期在9月20日前后。

朱卡(C.‘Julka’)為早花大花型單被品種，高2～2.5 m，花平盤單瓣形，紫羅蘭色，萼瓣6～8枚，中間有深紫紅色條帶，雄蕊亮白色和紫色多數(shù)?；◤?2～15 cm，葉長約5 cm，寬2.5 cm，花梗長約3 cm。初花日期約在3月25日，終花期在9月初，花期1次，長達4個月。

2.2 花芽分化時期觀察

2.2.1 花芽分化前期 頂芽內(nèi)分生組織的細胞活動開始活躍，其營養(yǎng)生長錐呈尖圓狀。在莖尖生長點的基部、生長錐兩側(cè)產(chǎn)生的突起即葉原基。生長錐隨著花芽的生長表面積逐漸變大，葉原基接著向上伸長進行分化[7]。3個大花鐵線蓮品種的花芽分化前期生長錐形態(tài)差異不大，‘薇安’的生長錐頂端較圓，基部較大(圖2)。

A：薇安；B：藍光；C：朱卡A: Clematis.‘Vyvyan Pennell’; B: Clematis.‘Blue Light’; C: Clematis.‘Julka’圖1 3種鐵線蓮供試材料Fig.1 Test materials of three kinds of clematis

A：薇安花芽分化前期；B：藍光花芽分化前期；C：朱卡花芽分化前期；GC：生長錐(頂端分生組織)；LP：葉原基A:Early flower bud differentiationof C.‘Vyvyan Pennell’; B:Early flower bud differentiation of C.‘Blue Light’; C:Early flower bud differentiation of C.‘Julka’; GC: Growth cone (apical meristem); LP: Leaf primordium圖2 不同大花鐵線蓮的花芽分化前期Fig.2 Early flower bud differentiation of different large flower clematises

2.2.2 花芽分化初期 在花芽分化初期，突起的生長點先端變的寬而肥大，呈近半球狀向上隆起?；ㄔ窃谏L點的頂端進行分化，當(dāng)植物生長發(fā)育到一定階段時由于分生組織活動進入生殖生長，莖頂端分生組織橫徑加大，逐漸由尖變平[7]，進而轉(zhuǎn)向花的分化形成花原基(圖3)。

2.2.3 萼片原基分化期 開始分化的頂端分生組織變寬，花原基的兩側(cè)有小突起產(chǎn)生，形成萼片原基。鐵線蓮“花瓣”由花瓣狀萼片分化而來，這個時期可稱之為花被原基的分化期(圖4)。

A：薇安花芽分化初期；B：藍光花芽分化初期；C：朱卡花芽分化初期；FP：花原基A: The beginning of the flower bud differentiation of C.‘Vyvyan Pennell’；B: The beginning of the flower bud differentiation of C.‘Blue Light’；C: The beginning of the flower bud differentiation of C.‘Julka’; FP: Flower primordium圖3 不同大花鐵線蓮的花芽分化初期Fig.3 The beginning of the flower bud differentiation of different large flower clematises

A：薇安萼片原基分化期；B：藍光萼片原基分化期；C：朱卡萼片原基分化期；CaP：萼片原基A: Sepal primordium differentiation stageof C.‘Vyvyan Pennell’; B: Sepal primordium differentiation stageof C.‘Blue Light’; C: Sepal primordium differentiation stageof C.‘Julka’; CaP: Sepal primordium圖4 不同大花鐵線蓮的萼片原基分化期Fig.4 Sepal primordium differentiation stage of different large flower clematises

2.2.4 雄蕊原基分化期 隨著萼片原基的伸長，在萼片原基內(nèi)側(cè)基部顯示出新的背腹形態(tài)，雄蕊原基形成。萼片發(fā)育時緊緊包裹花原基所產(chǎn)生的擠壓使得剛發(fā)生的幾枚雄蕊原基呈三角狀，隨著雄蕊原基的向心發(fā)生和數(shù)目不斷增多，雄蕊原基的螺旋狀序列逐漸明顯，花原基形狀均呈半球狀突起[8](圖5)。

2.2.5 雌蕊原基分化期 萼片原基此時期已分化成為花瓣狀萼片，部分雄蕊原基分化成雄蕊，在萼片和雄蕊原基的內(nèi)側(cè)，花托頂端中央向上部分出現(xiàn)多個突起，即雌蕊原基。此時雄蕊由小而圓的花瓣狀物變得寬大扁平，形成花瓣狀。雌蕊原基經(jīng)發(fā)育分化成雌蕊(圖6)。

2.2.6 重被與完全重被品種雄雌蕊瓣化形成期 相較于大花鐵線蓮單被品種朱卡，重被品種薇安與完全重被品種藍光在雄蕊原基和雌蕊原基已經(jīng)分化形成雄蕊和雌蕊后，會發(fā)生瓣化現(xiàn)象。重被品種薇安雄蕊瓣化，而雌蕊保持原有形態(tài)。完全重被品種藍光雌雄蕊均瓣化，且雄蕊先于雌蕊瓣化(圖7)。

A：薇安雄蕊瓣化形成；B：藍光雄雌蕊瓣化形成；0：胚珠；St：雄蕊； Pi：雌蕊A: Stamen petaloidof C.‘Vyvyan Pennell’; B: Stamen and pistil petaloid of C.‘Blue Light’; 0: Ovule; St: Stamen; Pi: Pistil圖7 重被及完全重被大花鐵線蓮的瓣化Fig.7 Petalody of double perianth and fully double large flower clematises

3 討 論

自然界有豐富多彩的重瓣觀賞植物，重瓣花起源方式大致分為6種，即積累起源、苞片起源、雌雄蕊起源、臺閣起源、重復(fù)起源和花序起源。雌雄蕊瓣化從形態(tài)上表現(xiàn)為雌雄蕊從外向內(nèi)減少或退化，花瓣數(shù)增加，花瓣由外向內(nèi)逐漸變小，直到出現(xiàn)花瓣和雄蕊的過渡形態(tài)，有些還有花絲或花藥的痕跡，或者僅花絲變成花瓣狀[9]。早年Lehmann和Sattler對毛茛科紅類葉升麻(Actaearubra)花發(fā)育的研究發(fā)現(xiàn)，萼片內(nèi)方二輪10個雄蕊原基在發(fā)育過程中可發(fā)育成花瓣，也可以形成雄蕊，即花瓣和雄蕊可以互相取代，證明了毛莨科的內(nèi)花瓣可能起源于雄蕊[10]。植物光合日變化與其生理生態(tài)因子受內(nèi)外環(huán)境的影響會有所不同[11]，植物花瓣的重瓣性表型是遺傳物質(zhì)和環(huán)境因子共同作用的結(jié)果[12]。以大花鐵線蓮重被品種薇安為典型代表的開花特性(晚春至早夏開重被花，在早秋二次開單被花)就是如此。

4 結(jié) 論

大花鐵線蓮重被花和完全重被花為典型的雌雄蕊起源方式。大花鐵線蓮的花芽分化順序都是由外向內(nèi)進行，其過程可分為花芽分化前期、花芽分化初期、萼片原基分化期，雄蕊原基分化期和雌蕊原基分化期；完全重被品種藍光在雄蕊雌蕊成形后產(chǎn)生瓣化現(xiàn)象。通常雄蕊先于雌蕊發(fā)生瓣化，而重被品種薇安僅雄蕊瓣化。觀賞植物的花朵重瓣程度高低對其觀賞效果有極大的影響，大花鐵線蓮花形特征和變化方式是其重要的觀賞特性，也是研究花器官發(fā)育與形成機制的理想材料。本研究初步闡明大花鐵線蓮重被花的起源方式，關(guān)于影響大花鐵線蓮重被花形成的主要環(huán)境因素及適值、可能控制鐵線蓮重被花形成的相關(guān)基因的篩選及基因克隆與表達分析等問題還有待進一步探究。