CT-1對臍血間充質(zhì)干細胞神經(jīng)分化作用

郎長會， 彭龍英， 李莎莎， 余小華， 束曉梅

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)神經(jīng)分化的潛能為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療帶來曙光[1]。人臍血來源MSCs(hUCB-MSCs)比骨髓來源MSCs更具優(yōu)勢[2]。但目前的難題是干細胞在腦內(nèi)難以維持足夠的數(shù)量并分化為神經(jīng)元。人們力圖發(fā)現(xiàn)具有支持干細胞神經(jīng)分化并維持存活的活性因子。心肌營養(yǎng)素1(cardiotrophin-1，CT-1)屬生神經(jīng)細胞因子家族中一員，可支持神經(jīng)元長期存活，抑制凋亡[3]。我們前一課題證明CT-1可促進胎腦來源NSCs神經(jīng)元分化及存活[4]。據(jù)此，本實驗我們將CT-1基因轉(zhuǎn)染hUCB-MSCs，探討CT-1是否可促進hUCB-MSCs神經(jīng)分化。

1 材料與方法

1.1 材料 人淋巴細胞分離液(天津顥洋生物科技)，hUCB-MSCs 專用培養(yǎng)基(Cyagen biosciences )，紅細胞裂解液(Ammonium chloride Stem cell公司)，胎牛血清(Gibco公司)，胰蛋白酶和PBS(北京中杉)，胰島素、肝素、BHA、維甲酸及bFGF(Sigma公司)，神經(jīng)誘導劑(Neural Induction medium，NIM)參照文獻[5](5 μ/ml氯化鉀、20 nmol/L孕酮、100 μmBHA、2%DMSO、30 nm亞硒酸鈉、5 μg/ml胰島素、100 μg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白 )；兔抗人CT-1多抗(博奧森)，兔抗人nestin、NeuN 及GFAP多抗(Abcam)；Adv-CT-1、Adv-EGFP(北京諾賽生物有限公司)；小鼠抗CD44-FIFC，小鼠抗IgG1-FIFC，小鼠抗CD29-PE，小鼠抗CD105-PE，小鼠抗人IgG1-PE及小鼠抗人CD34PerCP均購自于BD Biosciences。

1.2 方法

1.2.1 原代hUCB-MSCs培養(yǎng)及鑒定 經(jīng)產(chǎn)婦及家屬知情同意后，于遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院產(chǎn)科采集標本，參照文獻[5，6]對臍血進行原代培養(yǎng)，以1×106/ml的密度接種于10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、5 ng/ml堿性成纖維因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)的專用培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并傳代及擴增。取P3細胞進行實驗，流式細胞儀鑒定hUCB-MSCs的表面抗原CD34，CD29，CD44，CD105表達情況。

1.2.2 hUCB-MSCs轉(zhuǎn)染 計數(shù)P3細胞，每孔細胞數(shù)約5×103/ml種入96孔板，在37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)24 h，按感染復數(shù)(Multiplicity of infection，MOI)50、100、200及300 PFU/細胞加入Adv-CT-1(對照組加等量PBS)，每孔兩個復孔，6 h棄病毒液，轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h及96 h時熒光顯微鏡下觀察熒光表達，摸索最佳MOI及熒光表達最強時間。

將消化細胞以2×104/ml密度種于24孔板，以1.2.2所得最佳MOI的Adv-CT-1轉(zhuǎn)染hUCB-MSCs，設(shè)兩個復孔，在24 h、48 h和72 h時分別取出爬片，4%多聚甲醛固定，0.1%Triton X-100處理15 min，山羊血清封閉1 h，加入熒光標記的兔抗人CT-1抗體(1：100)，DAPI( 5 μg/ml) 避光染色3 min，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。

1.2.3 實驗分組 將hUCB-MSCs細胞分為4組：(1)神經(jīng)誘導劑組(NIM)：24 h時加入預誘導劑(5 μg/ml bFGF)，48 h時加入NIM；(2)CT-1組(Adv-CT-1+NIM)：先轉(zhuǎn)入Adv-CT-1，24 h時加入預誘導劑，48 h時加入NIM；(3)空病毒[(EGFP) Adv-EGFP+NIM)]組：先轉(zhuǎn)入Adv-EGFP，24 h時加入預誘導劑，48 h時加入NIM；對照組：48 h時換為無血清培養(yǎng)基。

1.2.4 神經(jīng)細胞標志物免疫熒光檢測 將誘導后細胞做細胞爬片，熒光步驟同前，分別向四組細胞分別加入等量兔抗人nestin(1∶100)、NeuN(1∶100)、GFAP(1∶100)，4 ℃過夜，分別加入用CY3標記山羊抗兔(1∶200)孵育1/2 h，DAPI( 5 μg/ml) 避光染色3 min，熒光顯微鏡下觀察；4 d后重復檢測。

2 結(jié) 果

2.1 hUCB-MSCs培養(yǎng)及鑒定 細胞接種24 h，倒置顯微鏡下觀察到大多數(shù)細胞為圓形，少部分細胞已貼壁；5 d可見多角形細胞和大量大而圓的破骨樣細胞及雜細胞；12 d后可見大量梭形細胞呈集落樣生長；平均約28 d可以傳代。傳代后約12 h細胞逐漸貼壁，呈均一的梭形細胞，7～10 d可再次傳代，P3細胞形態(tài)均一，6～7 d 細胞融合率達90%，流式細胞儀檢測結(jié)果，MSCs 均表達CD29、CD44、CD105，而不表達CD34；說明所培養(yǎng)細胞為hUCB-MSCs。

2.2 hUCB-MSCs轉(zhuǎn)染及Adv-CT-1表達

2.2.1 轉(zhuǎn)染Adv-CT-1 hUCB-MSCs轉(zhuǎn)染24 h后可見到微弱綠色熒光表達，48 h表達增強，72 h之后表達趨于穩(wěn)定。MOI為100 PFU/細胞時，轉(zhuǎn)染72 h效率較高(87.60%±1.36%)，且細胞形態(tài)、生長方式與對照組相同，細胞的正常增殖未受影響，熒光表達最理想，為最佳轉(zhuǎn)染復數(shù)。當MOI為200(86.40%±3.67%)和300PFU/細胞(91.96%±1.53%)時轉(zhuǎn)染效率逐漸增高，部分細胞開始變圓、漂浮，細胞正常增殖受到影響。

2.2.2 Adv-CT-1表達 轉(zhuǎn)染Adv-CT-1 24 h時其陽性率為65.09%±1.96%(見表1)，48 h、72 h及96 h時染轉(zhuǎn)率分別為86.62%±2.08%、91.77%±2.30%、90.25%±1.38%，72 h熒光表達最強，48 h、72 h、96 h與24 h相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，雖然72 h與48 h相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但72 h比48 h陽性率高，所以本實驗選72 h作為表達時間最強點，96 h與72 h相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3 誘導神經(jīng)細胞分化 CT-1組和NIM組經(jīng)誘導6 h時細胞胞體向胞核方向收縮、變細；EGFP組、對照組變化不明顯；誘導4 d時，原梭形的hUCB-MSCs已形成多級分支的細突起，CT-1組改變更加明顯，突起逐漸變長，交織成網(wǎng)狀，類似神經(jīng)元樣細胞(見圖1D)；NIM組也出現(xiàn)類似神經(jīng)樣細胞改變，不及CT-1組明顯；而對照組無明顯變化。

2.4 神經(jīng)細胞標志物表達

2.4.1 Nestin表達 誘導后6 h，各組Nestin(神經(jīng)干細胞標志物)大量表達，NIM組、CT-1組、EGFP組及對照組陽性率分別見表2，其中CT-1組陽性率均明顯高于其他各組(P<0.05)。至4 d時，Nestin表達量明顯減少，CT-1組陽性率降至10.31%±1.79%。

2.4.2 NeuN表達 誘導后6 h，CT-1組NeuN(神經(jīng)元標志物)少量表達(14.26%±2.20%)，4 d時陽性率達48.33%±2.53%(見表3)；EGFP組與對照組在6 h(2.72%±1.38%、2.75%±0.42%)與4 d時NeuN(5.09%±1.43 %、2.66%±0.91%)陽性率差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；各時間點NIM組(8.72%±1.15%、16.43%±0.77%)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4.3 GFAP表達 誘導后6 h，CT-1組GFAP(星型膠質(zhì)細胞標志物)見微弱表達，其陽性率為16.96%±4.41%(見表4)，對照組幾乎不表達，隨后GFAP表達逐漸升高，至誘導后4 d時陽性率升高至65.83%±5.17%，與其它三組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 不同時間點CT-1的表達

a：與24 h比較P<0.05 ；b：與48 h比較P>0.05；c：與72 h比較P>0.05

表2 不同時間點各組Nestin陽性率

a：與同時間點CT-1組比較P<0.05

表3 各組各時間點NeuN陽性率

a：與同時間點CT-1組比較P<0.05

表4 各組各時間點GFAP陽性率

a：與同時間點CT-1組比較P<0.05

3 討 論

CT-1是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型細胞因子，因其對心肌細胞有保護作用而得名。近年來發(fā)現(xiàn)其對神經(jīng)系統(tǒng)也起重要作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，外源性CT-1可促進胎腦來源的干細胞神經(jīng)分化及存活，轉(zhuǎn)染CT-1后NSCs可持續(xù)表達CT-1，移植入腦可減輕大鼠腦損傷并抑制海馬苔蘚發(fā)芽[4]，提示CT-1可支持NSCs的分化存活，對神經(jīng)細胞有保護和營養(yǎng)作用。

有關(guān)CT-1對hUCB-MSCs神經(jīng)分化的作用尚未見報道。CT-1屬白介素-6(interleukin-6，IL-6)超家族成員，與睫狀神經(jīng)生長因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)和心肌營養(yǎng)素樣細胞因子(CLC)等同屬生神經(jīng)細胞因子(neuropoietic cytokine)家族，是活性較強的神經(jīng)元營養(yǎng)因子[7～9]。有報道顯示生神經(jīng)細胞因子對神經(jīng)細胞有保護和營養(yǎng)作用，其中IL-6可促進少突膠質(zhì)細胞形成[10]；在大鼠腦缺血模型中，人臍血樣細胞分泌的細胞因子如LIF可保護神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞，可減少大腦梗死面積及白質(zhì)損傷[11]；生神經(jīng)生長因子家族中如IL-1、IL-10等可改善大腦局部損傷和免疫細胞浸潤引起的炎癥反應，可調(diào)節(jié)NSC再生、增生和NSC移植環(huán)境[12]。

我們的實驗發(fā)現(xiàn)CT-1可誘導hUCB-MSCs向神經(jīng)方向分化。hUCB-MSCs在 CT-1誘導下呈現(xiàn)神經(jīng)元細胞形態(tài)：胞體向胞核收縮，細胞突起逐漸變長交織成網(wǎng)狀。免疫熒光顯示CT-1誘導后hUCB-MSCs的神經(jīng)干細胞(Nestin)、神經(jīng)元(NeuN)及神經(jīng)膠質(zhì)細胞(GFAP)標志增高。目前認為，Nestin表達被認為是神經(jīng)干細胞或神經(jīng)祖細胞標志物[13]。GFAP是一種Ⅲ級中間纖維絲蛋白，是星形膠質(zhì)細胞的骨架蛋白，對神經(jīng)元的存活、免疫調(diào)節(jié)及信號傳導有重要作用[14]。NeuN只在神經(jīng)元中表達，是特異性神經(jīng)元特異物[15]。CT-1可誘導hUCB-MSCs向神經(jīng)方向分化的潛能為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的替代治療帶來無限曙光。

然而，CT-1是通過什么機制促進hUCB-MSCs神經(jīng)分化尚不明確。有報道腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurtrophic factor，BDNF)是通過同時活化絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(phosphoinositide-3 kinase/serine-threonine kinase，PI3K/Akt)兩條信號通路以促進hUCB-MSCs向神經(jīng)方向分化[5]。也有報道CT-1對心肌細胞的保護作用是通過同時MAPK和 PI3K/Akt兩條信號通路[16，17]。因此推測MAPK和PI3K/Akt信號通路可能參與CT-1誘導hUCB-MSCs神經(jīng)方向分化機制，需要在后續(xù)的實驗中進一步驗證。

a：對照組細胞仍呈梭形；B：EGFP組，少部分細胞胞體開始變圓；C：NIM組胞體向胞核回縮；D：CT-1組，大部分細胞出現(xiàn)神經(jīng)樣細胞形態(tài)(相差顯微鏡×100)

圖1 hUCB-MSCs誘導后6 h細胞形態(tài)

誘導后6 h，CT-1組Nestin的陽性率達86.82%±4.29%。圖從左到右分別為藍色熒光為DAPI，紅色熒光為目的蛋白，藍色熒光與紅色熒光的組合

圖2 CT-1組和對照組誘導6 h后Nestin的表達率(熒光顯微鏡×100)