新疆地區(qū)鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥菌株同源性分析

李 娟， 姚新寶， 郭淑麗， 楊麗瑋， 羅 斌， 王昌敏， 馬慧霞， 西麗娜依·買買提

鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）屬不發(fā)酵糖革蘭陰性桿菌，是引起醫(yī)院感染的重要條件致病菌之一。近年來，由鮑曼不動(dòng)桿菌引起的醫(yī)院感染逐年增加，尤其是重癥監(jiān)護(hù)室（ICU）內(nèi)的感染更嚴(yán)重[1-2]。鑒于新疆地域廣闊，僅烏魯木齊市臨床標(biāo)本無法反映全疆多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌克隆傳播趨勢(shì)。本項(xiàng)研究收集新疆9地（州）醫(yī)院ICU多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌72株，針對(duì)其耐藥性及同源性進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集全疆9地（州）2016年5月－2017年10月72株多重耐藥鮑曼不動(dòng)菌，剔除同一患者相同部位的重復(fù)菌株。其中，烏魯木齊38株、吐魯番4株、伊犁3株、石河子2株、昌吉7株、庫爾勒4株、阿克蘇5株、喀什3株、和田6株。菌株全部來源于住院患者：ICU 30株、外科ICU（SICU）18株、呼吸ICU（RICU）8株、燒傷創(chuàng)面修復(fù)科9株、呼吸科5株、神經(jīng)外科ICU（NSICU）2株。分離自痰液40株、血液11株、傷口分泌物11株、靜脈導(dǎo)管尖端6株、氣管抽吸物4株，所有收集菌株經(jīng)VITEK 2-Compact系統(tǒng)初步鑒定為鮑曼不動(dòng)桿菌復(fù)合群后，嚴(yán)格按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[3]第4版鑒定到種，置-80 ℃低溫冰箱保 存。

1.1.2 試劑和耗材 生化試驗(yàn)管（購自杭州微生物試劑有限公司）、MO BIO UltraCleanTM微生物DNA 提取試劑盒、DiversiLab 不動(dòng)桿菌試劑盒、DiversiLab 微流體芯片試劑盒和DNA 芯片（ 法國生物梅里埃公司）、 DNA聚合酶（N8080160，購自Thermo Fisher公司）、GN革蘭陰性桿菌鑒定卡片、革蘭陰性藥敏卡片（ 法國生物梅里埃公 司）為主要試劑耗材。

1.1.3 儀器 VITEK 2-Compact 微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)、VITEK MS全自動(dòng)快速微生物鑒定質(zhì)譜儀（ 法國生物梅里埃公司）、Agilent 2100 生物分析儀（美國Agilent Technologies 公司）、振蕩器（Vortex Genie 2 Vortex）、ABI 2720Thermal Cycler PCR儀、可見分光光度計(jì)（NanoDrop ND-1000）為主要實(shí)驗(yàn)儀器。

1.2 方法

1.2.1 藥敏試驗(yàn) 采用VITEK 2-Compact 系統(tǒng)藥敏卡（GN09），藥敏卡如無該抗菌藥物即采用紙片擴(kuò)散法（頭孢哌酮-舒巴坦、阿米卡星、多黏菌素B、替加環(huán)素、米諾環(huán)素、甲氧芐啶-磺胺甲唑、左氧氟沙星、氨芐西林-舒巴坦、頭孢吡肟、頭孢他啶、慶大霉素、妥布霉素、環(huán)丙沙星、亞胺培南、美羅培南、哌拉西林-他唑巴坦）。藥敏試驗(yàn)采用2016年CLSI推薦的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC 25922、大腸埃希菌ATCC 35218、銅綠假單胞菌ATCC 27853、肺炎克雷伯菌ATCC 700603購自上海漢尼生物技術(shù)有限公司。每周用大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC Ultra 27853標(biāo)準(zhǔn)菌株作藥敏質(zhì)控。

1.2.2 DiversiLab系統(tǒng)分型方法 DNA提?。涸谘矫笊咸羧蝹€(gè)菌落使用MO BIO UltraCleanTMMicrobial DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA。經(jīng)分光光度計(jì)NanoDrop 1000檢測(cè)DNA濃度，使用蒸餾水調(diào)整DNA的濃度為25～50 mg/L。

1.2.3 目標(biāo)片段擴(kuò)增 使用DiversiLab不動(dòng)桿菌DNA指紋圖譜試劑盒，配制25 μL PCR擴(kuò)增體系；使用2720 PCR儀擴(kuò)增，預(yù)變性94?℃ 2 min，94?℃變性30 s，50?℃退火30 s，70?℃延伸90 s為1個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，共擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；最后70?℃延伸3 min。

1.2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè) 將擴(kuò)增產(chǎn)物與凝膠按照順序注入含微流控芯片LabChips，使用Vortex Genie 2 振蕩器振蕩制備好的微流控芯片1 min，放入Agilent 2100生物分析儀對(duì)微流控芯片LabChips內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物片段進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 通過獨(dú)立的、安全的DiversiLab互聯(lián)網(wǎng)分析軟件，擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)果按照分組實(shí)時(shí)分析DNA、指紋圖譜數(shù)據(jù)，在線生成報(bào)告。相似性系數(shù)無差異，條帶無差異，相似性系數(shù)97%以上表示來源于同一克?。粌H有1～2個(gè)條帶差異，相似性系數(shù)95%～97%，疑似暴發(fā)，表示有親緣關(guān)系；不同來源的3個(gè)或以上條帶差異，相似性系數(shù)95%以下，表示無親緣關(guān)系[4]。

2 結(jié)果

2.1 全疆鮑曼不動(dòng)桿菌臨床資料

符合本研究多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌72株，臨床診斷以術(shù)后感染為主；標(biāo)本采樣時(shí)間為2016年5月－2017年10月。其他地區(qū)菌株除和田2株分布在呼吸科外，其他菌株來源于重癥醫(yī)學(xué)科；臨床診斷以肺部感染為主；所有痰液標(biāo)本經(jīng)涂片均判定為合格標(biāo)本。

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

72株碳青霉烯類耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌均為多重耐藥菌，見表1。

2.3 全疆菌株同源性分析

根據(jù)擴(kuò)增片段的多態(tài)性比較菌株間相似性。以95%作為標(biāo)準(zhǔn)可分為4型：1型為主要克隆，占59.7%；其次是3型，占16.7%；4型和2型分別為12.5%和11.1%。其中3型是烏魯木齊市獨(dú)有的克隆株；2型主要分布在烏魯木齊市、和田地區(qū)；而1型在全疆9個(gè)地區(qū)均有分布，其中烏魯木齊市占46.5%；4型主要分布于昌吉、和田地區(qū)，呈現(xiàn)特有的顯著條帶。1型相似性系數(shù)為95%～97%，而2、3、4型相似性系數(shù)均大于97%。通過列表，可以看出在新疆地區(qū)引起各種感染的鮑曼不動(dòng)桿菌主要是1型克隆菌株。見表2。

表1 72株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)抗菌藥物耐藥率和敏感率Table 1 Susceptibility pro file of 72 multi-drug resistant Acetobacter baumannii strains（%）

表2 新疆地區(qū)72株臨床分離多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的同源性和所致的感染性疾病Table 2 Homology among the 72 clinical strains of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii isolated from Xinjiang and the related infections

2.4 1型與3型克隆株耐藥性比較

鑒于1型克隆株為全疆流行株，而3型克隆株是烏魯木齊市獨(dú)有，比較其耐藥結(jié)果顯示：1型克隆株耐藥率稍低于3型，除替加環(huán)素2株耐藥，多黏菌素B 1株耐藥全部來源于3型克隆株，對(duì)其他抗菌藥物耐藥率的比較。見表3。

3 討論

鮑曼不動(dòng)桿菌是近年來全球范圍內(nèi)造成醫(yī)院感染流行的主要病原菌之一[5]，特別是耐碳青霉烯類菌株，給臨床治療帶來很大的困難。有文獻(xiàn)報(bào)道鮑曼不動(dòng)桿菌具有較強(qiáng)的生物膜形成能力，當(dāng)細(xì)菌以生物膜形式存在時(shí)，耐藥性及致病性明顯增強(qiáng)[6-7]。新疆自治區(qū)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)專家委員會(huì)數(shù)據(jù)分析，2016年鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類耐藥率為56.4%，而我院為75.5%，也高于2015年CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)已接近70%的報(bào)道[8]。另外，住院時(shí)間延長以及使用昂貴的抗生素，多重耐藥菌所致醫(yī)源性感染發(fā)生率、病死率和醫(yī)療費(fèi)用均明顯增高。

表2 （續(xù)）Table 2（continued）

表3 多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌1型與3型克隆株對(duì)抗菌藥物的耐藥率和敏感率Table 3 Susceptibility pro files of Clone 1 and Clone 3 multidrug resistant Acinetobacter baumannii strains（%）

表3 （續(xù)）Table 3（continued）（%）

本研究分別從全疆9地（州）醫(yī)院ICU收集符合要求的72株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌，目的是了解各地區(qū)醫(yī)院耐藥克隆株分布情況，其研究結(jié)果能為全疆各級(jí)醫(yī)院院感管理監(jiān)控部門進(jìn)行監(jiān)控提供重要的理論依據(jù)。諸多學(xué)者相繼報(bào)道各種基因分型方法優(yōu)缺點(diǎn)[9-11]。本研究采用DiversiLab 系統(tǒng)，參照曲燕燕等[12]報(bào)道分析，該方法具有操作簡(jiǎn)便、高通量和分型能力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)?；谥貜?fù)序列PCR引物與許多分布在整個(gè)基因組上特異性的重復(fù)序列配對(duì)；經(jīng)過PCR擴(kuò)增形成多個(gè)不同長短的片段，這些擴(kuò)增的片段根據(jù)其質(zhì)量差異，經(jīng)電泳分析，得到由多條帶組成、強(qiáng)弱不一、專一性的重復(fù)序列PCR DNA指紋圖譜。通過此方法對(duì)全疆多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行同源性研究，結(jié)果分為4個(gè)不同的克隆型：①1型基因型在全疆9地（州）檢測(cè)到同一來源的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌43株，各地區(qū)均有分布。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：分布于烏魯木齊20株、阿克蘇5株、吐魯番4株、喀什3株、庫爾勒4株、石河子2株、伊犁3株、和田和昌吉各1株，說明在全疆不同地區(qū)、醫(yī)院、病房或同一地區(qū)、醫(yī)院、病房中發(fā)生多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的播散。是否因碳青霉烯類耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的克隆傳播還有待進(jìn)一步研究。 ②3型為烏魯木齊獨(dú)有克隆株，臨床資料顯示2017年8月從SICU不同燒傷患者送檢血液、分泌物、痰液標(biāo)本中同時(shí)培養(yǎng)出多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌5株；同一時(shí)間段又從SICU另1例患者引流液標(biāo)本中分離1株多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌，該患者臨床診斷椎管狹窄； 8月底9月初燒傷患者全部轉(zhuǎn)入燒傷創(chuàng)面修復(fù)科，從送檢靜脈導(dǎo)管尖端、分泌物、痰液標(biāo)本培養(yǎng)出與SICU相同耐藥菌；同時(shí)從該科室電擊傷患者送檢的分泌物標(biāo)本，也同樣培養(yǎng)出與SICU相同耐藥菌，根據(jù)擴(kuò)增片段的多態(tài)性比較菌株間相似性，相似性系數(shù)在95%～100%，提示檢測(cè)到同一來源多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌；說明該克隆株在SICU有交叉?zhèn)鞑ァICU與燒傷創(chuàng)面修復(fù)科病房有交叉?zhèn)鞑?。其中?株克隆株來源于和田地區(qū)醫(yī)院ICU，可能與患者轉(zhuǎn)院有關(guān)。③ 2型基因型出現(xiàn)在烏魯木齊和和田地區(qū)，此群特點(diǎn)在不同ICU（RICU、SICU、NSICU）患者標(biāo)本中分離出6株相同基因型，并且3個(gè)ICU分布在醫(yī)院不同區(qū)域和樓層，其次ICU不陪護(hù)，醫(yī)護(hù)人員出入病房也做好個(gè)人防護(hù)，但患者有轉(zhuǎn)科情況，導(dǎo)致傳播的主要因素與環(huán)境污染、手衛(wèi)生有著密切關(guān)系，與劉延媛等[13]報(bào)道一致。同時(shí)發(fā)現(xiàn)SICU存在不同菌株，提示可能發(fā)生不同克隆株在醫(yī)院的交叉感染。和田有2株菌，分離自呼吸科病房，屬同一基因型，提示烏魯木齊與和田也具有同源性。④4型基因型分布于昌吉、和田地區(qū)，呈現(xiàn)特有的顯著條帶；通過臨床資料分析： 2016年8月10日分離自呼吸科病房，標(biāo)本為痰液，臨床診斷肺部感染；同年8月23日分離自ICU，標(biāo)本為痰液，臨床診斷慢性支氣管炎急性發(fā)作；同年9月6日分離自呼吸科病房，標(biāo)本為痰液，臨床診斷肺氣腫，以上3株耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌來自和田醫(yī)院，相似性系數(shù)達(dá)99%，說明來源同一克隆菌株，存在于前例感染患者出院20 d后，在ICU的患者標(biāo)本中及出院1個(gè)月后，仍然在同一科室患者標(biāo)本中檢出具有同源性的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌，提示病房環(huán)境衛(wèi)生消毒不徹底，未能完全殺滅多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌；此克隆株為和田地區(qū)流行株。昌吉地區(qū)共有6株菌，屬4型克隆株，全部菌株來自ICU，入院與出院患者之間相差4～5個(gè)月，標(biāo)本為痰液，臨床診斷重癥肺炎、肺部感染；提示ICU患者之間有交叉感染，表明昌吉與和田地區(qū)具有同源性，也是昌吉地區(qū)的主要流行株。同時(shí)比較1型與3型克隆株耐藥率，3型略高于1型。

綜上所述，分析全疆克隆株流行特點(diǎn)，各地（州）醫(yī)院要高度重視，特別是對(duì)需要轉(zhuǎn)院、轉(zhuǎn)科時(shí)，進(jìn)行病房環(huán)境中鮑曼不動(dòng)桿菌的監(jiān)測(cè)；切斷多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌在全疆地區(qū)之間、醫(yī)院之間、科室之間、病房內(nèi)的擴(kuò)散傳播及散在傳播，防止交叉感染。