棉花光籽基因n2的精細(xì)定位

李思敏，左東云，程海亮，張友平，王巧連，劉珂，馮曉旭，耿洪偉，宋國立*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，烏魯木齊830052；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/ 棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南安陽455000）

棉花（Gossypium）優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)一直是育種的重要目標(biāo)[1-2]。一般認(rèn)為纖維細(xì)胞是以線性細(xì)胞生長模式進(jìn)行延伸，由胚珠外表皮細(xì)胞發(fā)育而成[3-4]。棉花纖維的分化和發(fā)育包括原始細(xì)胞的分化和突起（開花后－3～3 d）、纖維細(xì)胞的伸長（開花后2～20 d）、次生壁加厚（開花后15～45 d）和脫水成熟（開花后45～50 d）4 個(gè)階段，各個(gè)階段之間相互重疊，沒有明顯的界限，纖維細(xì)胞的分化時(shí)間決定纖維的長度，長纖維在早期分化，而短纖維在晚期分化。棉纖維的品質(zhì)性狀主要包括纖維長度、強(qiáng)度、伸長率、馬克隆值等，這些性狀主要受基因型的控制，其中纖維的起始與伸長直接影響纖維的數(shù)量與長度，而次生壁加厚期纖維素的合成則影響纖維的強(qiáng)度與馬克隆值等性狀[5]。

棉花纖維發(fā)育過程與擬南芥（Arabidopsis）毛狀體發(fā)育具有相似性?，F(xiàn)已證明，MYB 家族蛋白在擬南芥毛狀體發(fā)育和棉纖維生長發(fā)育中都有重要作用，而復(fù)合體MYB-bHLH-WD40（MBW）控制擬南芥毛狀體的啟動(dòng)，主要包括GL1、GL3和TTG1 這3 個(gè)基因[6-10]?？刂泼蘩w維起始的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因（MYB25-like）編碼MIXTA 類的MYB 轉(zhuǎn)錄因子，與形成MBW 的GL1 屬于不同類型，在纖維發(fā)育過程中不可缺失；干涉Gh-MYB25-like基因，可導(dǎo)致棉花種子無纖維，其他部分毛狀體不受影響[11-14]。目前，棉花中存在多種纖維發(fā)育突變體，主要有陸地棉無絨有絮突變體N1和n2，超短纖維突變體Li1、Li2和Li3，無絨無絮突變體MD17、SL1-7-1 和XZ142。從20 世紀(jì)初，前人就開始了對陸地棉光籽突變體的遺傳研究。Thadania 等研究認(rèn)為，陸地棉光籽無短絨性狀是單基因控制的顯性性狀[15-16]。Kohel 等分別把顯性光籽基因N1和隱性光籽基因n2定位在同源染色體12 和26 號(hào)上[17]。Endrizzi 等采用單端體定位的方法，將光籽基因n2定位到染色體D12 上[18]。而Rong 等認(rèn)為n2位于染色體A12 上[19]。宋麗等在海陸群體中將n2定位在染色體A12 上，在陸陸群體中將n2定位在了D12 上[20]。

本研究以陸地棉光籽突變體n2和海島棉新海21 為親本配制雜交組合，收獲F1種子，并自交產(chǎn)生F2群體，對該群體纖維發(fā)育性狀進(jìn)行調(diào)查和遺傳分析，完成光籽基因n2的初步定位和精細(xì)定位，對候選區(qū)間進(jìn)行基因預(yù)測，克隆候選基因，并分析其在親本中的表達(dá)差異，為揭示n2基因控制棉花纖維起始的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與表型數(shù)據(jù)收集

本試驗(yàn)配制雜交組合所用親本材料為海島棉品種新海21（Xinhai 21）和陸地棉光籽突變體n2，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所種質(zhì)中期庫提供，并由本課題在田間進(jìn)行多年連續(xù)自交保存。2個(gè)親本纖維發(fā)育性狀穩(wěn)定，新海21 的表型為短絨，n2的表型為光籽。用其配制的F1也經(jīng)過多年調(diào)查，纖維發(fā)育表型性狀同新海21 一致。

本試驗(yàn)共構(gòu)建2 個(gè)F2群體，群體Ⅰ由554 個(gè)單株組成，群體Ⅱ由3 443 個(gè)單株組成。表型性狀分為有短絨和無短絨（光籽）2 種。選取F2群體各單株上成熟開裂的棉鈴，去除長纖維后觀察棉籽上短絨的有無，每次均與親本比對，與新海21 表型一致的標(biāo)記為有短絨，與n2表型一致的標(biāo)記為光籽。但在分離群體中，有一些處于中間表型的單株，其種子表面大部分為光籽，僅在珠孔端和合點(diǎn)端有少量短絨，在性狀調(diào)查時(shí)，參照Du 等[21]和丁業(yè)掌等[22]的分類方法，將其歸為光籽。進(jìn)行卡方適合性檢驗(yàn)，以確定F2群體性狀是否符合3∶1 的分離比。

1.2 DNA的提取和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）

采用宋國立等[23]改良的CTAB 法從親本和F2群體的新鮮葉組織中提取基因組DNA。所有引物由蘇州金唯智生物科技有限公司和生工生物工程（上海）股份有限公司合成。配制PCR 反應(yīng)體系所用到的TaqDNA 聚合酶、10×PCR Buffer 以及dNTPs 等試劑均購自北京全式金基因生化科技有限公司。PCR 反應(yīng)體系中模板DNA 30 ng，2.5 mmol·L－1dNTPs 0.5 μL，10×PCR Buffer 1 μL，5 U·μL－1TaqDNA 聚合酶0.1 μL，10 μmol·L－1正反向引物各0.2 μL，加ddH2O至10 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃5 min；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃1 min，25 個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min。PCR 產(chǎn)物用8%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。

1.3 分子標(biāo)記的開發(fā)

宋麗等[20]將n2基因定位在A12 上標(biāo)記NAU0943 和BNL1679 之間的6 cM 區(qū)間內(nèi)。利用軟件SciRoKo 34 在A12 序列中查找簡單序列重復(fù)（Simple sequence repeat，SSR）位點(diǎn)，并將得到的引物于2 個(gè)親本間進(jìn)行多態(tài)性篩選。當(dāng)n2基因縮小到?jīng)]有可用的多態(tài)性SSR 標(biāo)記的區(qū)間范圍后，對任意序列進(jìn)行擴(kuò)增，用于加密圖譜。所有引物序列均由Primer 5 軟件獲得。

1.4 基因的精細(xì)定位

從群體Ⅰ中挑選200 個(gè)單株進(jìn)行初步定位，其中包括150 株毛籽單株，50 株光籽單株。利用Joinmap 4.0 進(jìn)行連鎖分析。通過作圖將n2基因定位到標(biāo)記NAU0943 和BNL1679 之間的6 cM（centimorgan）區(qū)間后，根據(jù)SSR 在染色體上的位置提取目標(biāo)區(qū)間的序列，繼續(xù)設(shè)計(jì)新的SSR 引物，并篩選出具有多態(tài)性的引物，用得到的引物擴(kuò)增群體Ⅱ所有單株的DNA，根據(jù)重組數(shù)據(jù)，將目標(biāo)區(qū)域鎖定在更小的范圍內(nèi)。

1.5 定位區(qū)間候選基因預(yù)測

根據(jù)精細(xì)定位的結(jié)果得到候選區(qū)間，從棉花注釋數(shù)據(jù)庫（http://cgp.genomics.org.cn）獲得預(yù)測的基因序列，并在表達(dá)序列標(biāo)簽（Expression sequence tag，EST）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST 比對以確認(rèn)預(yù)測基因的準(zhǔn)確性，進(jìn)而獲得候選基因。

1.6 候選基因的表達(dá)量分析

采集開花－3 d、－1 d、0 d、1 d、3 d、5 d、7 d、10 d 的胚珠，用天恩澤基因科技公司的RNAout 2.0 試劑盒提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄所用試劑盒PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）和熒光定量試劑盒TaKaRa SYBR Premix ExTaqⅡ（Perfect Real Time）均購自寶生物（大連）生物公司。實(shí)時(shí)熒光定量（Quantitative real time，qRT）-PCR 反應(yīng)體系：模板cDNA 2 μL，10 μmol·L－1正、反向引物各0.8 μL，SYBR?RPremix ExTaqⅡ （2×）10 μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4 μL，ddH2O 6 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)；95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s（ABIPRISM@7500-Fast Real-Time PCR system）。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)qRT-PCR 引物，內(nèi)參基因設(shè)為ACTIN，引物信息參見表1。表達(dá)量分析用2－ΔΔCt法。

表1 qRT-PCR所用基因及引物序列Table 1 Genes and primers used in qRT-PCR verification

2 結(jié)果與分析

2.1 性狀調(diào)查及遺傳分析

對2 個(gè)F2分離群體的3 997 個(gè)單株進(jìn)行田間性狀調(diào)查，對表型數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到光籽單株690 株，毛籽單株2 994 株，中間性狀單株313株（歸為光籽類型[21-22]）。結(jié)果顯示，2 個(gè)群體的纖維發(fā)育性狀分離比為3∶1?？ǚ竭m合性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，分離群體的性狀分離比符合孟德爾遺傳分離規(guī)律（χ2＝0.59＜χ20.05＝3.84），與前人的研究結(jié)果[20]一致。

2.2 SSR標(biāo)記的開發(fā)與篩選

結(jié)合AD 基因組序列，首先在70～76 Mbp 區(qū)間內(nèi)設(shè)計(jì)了96 對引物，均分布在A12 上。將各引物在2 個(gè)親本間進(jìn)行多態(tài)性篩選，共得到20 對多態(tài)性SSR 標(biāo)記。利用這20 對引物進(jìn)行連鎖分析，得到13 對與目標(biāo)基因連鎖的標(biāo)記（表2）。當(dāng)n2基因縮小到?jīng)]有可用的多態(tài)性SSR 標(biāo)記區(qū)間范圍后，對任意序列進(jìn)行擴(kuò)增，在親本間進(jìn)行多態(tài)性篩選，得到10 對與目標(biāo)基因緊密連鎖的SSR 標(biāo)記（表2）。

2.3 光籽基因n2的初步定位

宋麗等[20]將n2基因定位在A12 上標(biāo)記NAU0943 和BNL1679 之間的6 cM 區(qū)間內(nèi)。本試驗(yàn)在進(jìn)一步加密遺傳圖譜的基礎(chǔ)上，驗(yàn)證了該區(qū)間的準(zhǔn)確性。從群體Ⅰ中挑選200 個(gè)極端單株的小群體，其中包括50 株光籽單株，150 株毛籽單株，結(jié)合已有的結(jié)果和新的SSR 標(biāo)記在該群體中的交換率，將目標(biāo)區(qū)域鎖定在了NAU0943 和Z10之間，物理距離約為615 kbp（圖1a）。

表2 與n2基因連鎖的標(biāo)記Table 2 Polymorphic markers linked with the n2 gene

圖1 n2基因的定位Fig.1 Mapping of n2 gene

2.4 光籽基因n2的精細(xì)定位

初步定位得到10 個(gè)與目標(biāo)基因緊密連鎖的SSR 標(biāo)記，為驗(yàn)證定位區(qū)間并進(jìn)一步縮小n2的范圍，以這10 個(gè)標(biāo)記擴(kuò)增群體Ⅱ所有單株的DNA，根據(jù)重組數(shù)據(jù)，進(jìn)一步將候選區(qū)間縮小至P61 與Z10 之間（圖1b，c），物理距離181 kbp。

2.5 候選區(qū)間基因預(yù)測

以候選區(qū)間的基因組參考序列進(jìn)行基因預(yù)測，結(jié)合基因組的注釋結(jié)果，在181 kbp 的序列中存在7 個(gè)預(yù)測基因，分別為1414、1415、72098、1417、1418、1419、1420（表3）。

2.6 候選基因的表達(dá)量分析

候選基因中，72098 在所選時(shí)期的2 個(gè)親本中的表達(dá)量都有顯著差異（圖2），而其他6個(gè)基因在2 個(gè)親本中的表達(dá)量沒有顯著差異。這說明在棉花胚珠中，該基因表達(dá)量的不同可能是造成纖維發(fā)育性狀差異的原因，它可能在光籽形成中起重要作用。

表3 定位區(qū)間內(nèi)7個(gè)候選基因的注釋及基因全長Table 3 Annotation and full length of seven candidate genes in mapping interval

圖2 候選基因72098在2個(gè)親本中的相對表達(dá)量比較Fig.2 Expression analysis of the candidate gene 72098 in the parents

3 討論與結(jié)論

棉花纖維作為天然紡織原料在國民生產(chǎn)中舉足輕重，而纖維突變體，尤其是光籽突變體更是棉花遺傳育種上重要的種質(zhì)資源。陸地棉纖維突變體的遺傳研究，可以豐富陸地棉種質(zhì)資源。而棉種上附著的短絨纖維往往可能攜帶許多病菌，易造成各類病害（如黃萎病等）的發(fā)生[24]。如果棉種上有短絨，則會(huì)嚴(yán)重阻礙種子的吸水膨脹，從而影響發(fā)芽率，使棉花生產(chǎn)受到一定的影響。而光籽突變體材料具有種子不易傳播病蟲害且吸水快，出苗整齊，纖維強(qiáng)度好，纖維容易從種子上分離等優(yōu)點(diǎn)，是棉花育種的重要資源。該研究以陸地棉光籽突變體為切入點(diǎn)，對棉纖維材料進(jìn)行生物學(xué)研究，進(jìn)而闡明棉纖維分化發(fā)育的分子機(jī)理，對進(jìn)一步提高棉纖維產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。

陸地棉纖維發(fā)育突變體一般是由于1 個(gè)或少數(shù)幾個(gè)質(zhì)量性狀基因發(fā)生突變造成的。前人研究表明，n2位于 A12 上標(biāo)記NAU0943 和BNL1679 之間的6 cM 區(qū)間內(nèi)[20]。但該距離對于基因克隆或育種利用來說不夠接近。隨著棉花基因組序列的發(fā)展，利用高分辨率遺傳圖譜和全基因組序列，大大加快了基因定位和克隆的步伐[25-27]。在本研究中，我們選取陸地棉光籽突變體n2及海島棉品種新海21 為親本，為了確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，構(gòu)建了2 個(gè)分離群體，分別用于n2基因的初步定位和精細(xì)定位，定位群體達(dá)3 997 個(gè)單株。根據(jù)棉花基因組序列，開發(fā)了一批染色體特異的分子標(biāo)記，當(dāng)目標(biāo)區(qū)域鎖定到較小范圍之內(nèi)后，根據(jù)重組單株的個(gè)數(shù)，確定目標(biāo)基因的候選區(qū)間，并用連鎖標(biāo)記擴(kuò)增群體Ⅱ所有單株的DNA，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。原則上，如果群體數(shù)目增大，得到的重組單株數(shù)目就越多，定位區(qū)間也越小。最后，n2基因被定位在染色體A12 上181 kbp 區(qū)間內(nèi)，定位區(qū)間中含有7 個(gè)候選基因，并通過檢索EST 庫得到確認(rèn)。候選基因的qRT-PCR 分析結(jié)果顯示，基因72098 在所選時(shí)期的2 個(gè)親本中的表達(dá)量都有顯著差異，而其他6個(gè)基因在2 個(gè)親本中的表達(dá)量沒有顯著差異。

基因72098 編碼蛋白激酶。據(jù)報(bào)道，擬南芥中含有多個(gè)鈣依賴蛋白激酶（Calcium-dependent protein kinases，CDPKs）基因，其中有成員被報(bào)道與根毛生長或花粉管通道伸長有關(guān)。cDNA 芯片及qRT-PCR 的數(shù)據(jù)均顯示CPK1、CPK32 和CPK5 的表達(dá)在纖維伸長期顯著升高。利用CDPK 的通用底物檢測棉纖維發(fā)育不同時(shí)期鈣離子依賴型蛋白激酶總活性發(fā)現(xiàn)，隨著纖維的伸長，CDPK 總活性顯著增加，在開花后10～15 d達(dá)到最高。在沒有纖維的棉花突變體中，CDPK總活性一直維持在較低水平，提示CDPK 類激酶在纖維發(fā)育過程中扮演重要角色[28-29]。由此我們猜測，基因72098 可能在光籽形成中起重要的作用，且為候選基因的可能性較大。但光籽表型的差異是由于基因序列本身差異還是表達(dá)量差異引起的，亦或者是兩者共同作用導(dǎo)致的，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。