阿那白滯素對病毒性心肌炎小鼠的保護(hù)作用及對TLR4/TRAF6通路的影響

病毒性心肌炎屬于心血管系統(tǒng)疾病，臨床表現(xiàn)無明顯特異性，大部分病人病情較輕，有一部分逐漸發(fā)展為慢性心肌炎，或因長期得不到治療病毒發(fā)生病理免疫反應(yīng)，發(fā)展為擴(kuò)張型心肌病[1]。目前研究認(rèn)為由病毒侵入所導(dǎo)致的心肌組織炎癥反應(yīng)是病毒性心肌炎病情加重的重要原因[2-3]。阿那白滯素屬于重組人白介素-1受體拮抗劑，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療中應(yīng)用廣泛。國外最新研究顯示阿那白滯素可用于心肌炎治療，且抑制炎癥反應(yīng)效果較好，國內(nèi)關(guān)于阿那白滯素治療心肌炎方面的報(bào)道較少[4]。本研究通過制備病毒性心肌炎小鼠模型，給予阿那白滯素干預(yù)，旨在探究阿那白滯素對心肌的保護(hù)作用以及對Toll樣受體4(TLR4)與腫瘤壞死因子受體活化因子6(TRAF6)信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及實(shí)驗(yàn)病毒 4周齡無特定病原體(SPF)清潔級雄性BALB/c小鼠40只，體重(18.64±2.18)g，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所提供，合格證書為：SYXK(粵)2016-0315，所有小鼠均在25 ℃、濕度為80%的環(huán)境中統(tǒng)一喂養(yǎng)，嚴(yán)格按照SPF級動物飼養(yǎng)要求進(jìn)行飼養(yǎng)?？滤_奇病毒B3(coxsackie virus B3，CVB3)由南方醫(yī)科大學(xué)病原微生物實(shí)驗(yàn)室惠贈，該病毒已在Hela細(xì)胞上傳代，經(jīng)過反復(fù)凍融3次后測定半數(shù)組織感染劑量為10-3/L。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 阿那白滯素(湖北荊州市天濟(jì)藥業(yè)有限公司；生產(chǎn)批號：20160930；規(guī)格：每片0.3 g)；心肌肌鈣蛋白T(cTnT)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒購自上海生物工程有限公司；兔抗鼠TLR4、TRAF6、核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)、髓樣分化蛋白88(myeloid differentiation protein 88，MyD88)、TIR結(jié)構(gòu)域接頭分子(TIR domain junction molecule，TRIF)單克隆抗體購于美國Gibco公司；二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二體購于美國R&D公司；伊紅、蘇木素購于美國Sigma公司；ABC試劑盒購于美國Vector公司；2×SYBR Premix Ex Taq II購于寶生物工程(大連)有限公司；RNA提取和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司；胎牛血清、α-MEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；胰蛋白酶購于美國Amresco公司；CO2培養(yǎng)箱購于Forma Scientific公司，低溫離心機(jī)、蛋白凝膠成像儀購于Bio-Red公司。Nikon80I顯微鏡購于日本Nikon公司。cx9全自動生化檢測儀購于美國貝克曼公司。

1.3 小鼠病毒性心肌炎模型制備及分組 將小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法平均分為4組，正常組(A組)、模型組(B組)、阿那白滯素低劑量組(C組)與阿那白滯素高劑量組(D組)，每組10只。正常組小鼠注射不含CVB3的病毒稀釋液，模型組經(jīng)腹腔注射0.1 mL CVB3病毒懸浮液，每日1次，連續(xù)注射3 d；阿那白滯素低劑量組在模型組基礎(chǔ)上經(jīng)腹腔注射0.02 mL/g阿那白滯素，每日給藥1次，給藥2周；阿那白滯素高劑量組在模型組基礎(chǔ)上經(jīng)腹腔注射0.2 mL/g阿那白滯素，每日給藥1次，給藥2周。

1.4 標(biāo)本處理與收集 在小鼠最后1次給藥處理24 h后進(jìn)行斷頭取血，在血液中加入抗凝劑，迅速分離心臟，將其中一部分置于-80 ℃冰箱中保存，另一部分加入10%多聚甲醛中固定后常規(guī)制備石蠟切片。

1.5 血清cTnT、CK-MB、MDA、SOD、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)水平測定 采用cTnT、CK-MB、MDA、SOD、TNF-α、IL-1、IL-6酶聯(lián)免疫檢測試劑盒以及全自動生化檢測儀進(jìn)行操作，嚴(yán)格按照試劑盒操作以及儀器說明書執(zhí)行。

1.6 心肌組織蘇木素-伊紅染色(HE染色)以及馬松染色(Masson染色) HE染色：將制備好的心臟組織石蠟切片在二甲苯溶液中固定30 min，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%、95%、85%、75%的乙醇溶液中分別進(jìn)行脫水5 min；流水沖洗后，加入蘇木素進(jìn)行染色10 min，浸入1%鹽酸后用蒸餾水進(jìn)行沖洗。加入伊紅染液均進(jìn)行染色3 min，依次在75%、85%、95%、100%中脫水2 min，加入二甲苯進(jìn)行透明處理，滴加中性樹脂進(jìn)行封片，將切片放置顯微鏡下進(jìn)行觀察，每張切片選取5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)視野中壞死區(qū)域、炎癥浸潤區(qū)域占整個(gè)視野的比例，無病變區(qū)域?yàn)?分，病變區(qū)域<25%為1分，病變區(qū)域25%～<50%為2分，50%～75%為3分，>75%為4分。Masson染色：將組織制備成石蠟切片，加入二甲苯進(jìn)行脫蠟，在乙醇中進(jìn)行脫水后，流水清洗后進(jìn)行鉻化處理，加入蘇木精染色5 min，水洗后在鹽酸乙醇中分化，水洗后加入伊紅染液染色5 min，加入2%冰醋酸進(jìn)行清洗，置于1%磷鉬酸中5 min，加入苯胺藍(lán)染色5 min，加入2%冰醋酸進(jìn)行清洗后，用無水乙醇進(jìn)行脫水處理后封片。利用Metic Med 6.0軟件計(jì)算心肌膠原纖維所占比例(CVF)，計(jì)算方式為：CVF=膠原面積/總面積。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞凋亡 將心臟組織剪碎加入胰酶溶液進(jìn)行消化，用尼龍網(wǎng)過濾收集心肌細(xì)胞，在75%冰乙醇中過夜固定，離心后收集細(xì)胞，在磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液中清洗，調(diào)整細(xì)胞密度為106/mL，添加核糖核酸酶(RNAase)室溫下孵育30 min，加入碘化丙啶(PI)溶液后室溫下孵育10 min，在細(xì)胞流式儀中分析細(xì)胞DNA含量，利用Cellfit軟件選取104個(gè)細(xì)胞分析，觀察并記錄AP區(qū)域細(xì)胞比例，即細(xì)胞凋亡率。

1.8 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)( RT-PCR)測定心肌組織中TLR4、TRAF6、NF-κB、MyD88、TRIF mRNA表達(dá) 從冰箱中取出冰凍心臟組織，在PBS緩沖液中清洗后，用無菌剪刀剪碎，采用RNA提取試劑盒(Takara公司)對總RNA進(jìn)行提取后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-PCR引物由廣州Invitrogen公司合成，序列詳見表1。反應(yīng)體系：10×cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，H2O 8 μL， 2×SYBR Mix 10 μL。按照反應(yīng)程序95 ℃ 2 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。利用CFX manager 3.0軟件進(jìn)行Cq值分析，以GADPH作為內(nèi)參基因按照2-ΔΔCq算法進(jìn)行基因相對定量表達(dá)分析。

表1 RT-PCR引物序列

1.9 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測心臟組織TLR4、TRAF6、NF-κB、MyD88、TRIF蛋白表達(dá) 將心臟組織剪碎后加入蛋白裂解液在冰上反應(yīng)30 min，3 000 r/min離心10 min，收集上清液，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度，制備8%分離膠、12.5%濃縮膠，蛋白上樣量統(tǒng)一為30 μg，當(dāng)樣品進(jìn)入濃縮膠后電壓設(shè)置為80 V，進(jìn)入分離膠后，電壓調(diào)整為120 V，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移蛋白凝膠至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜反應(yīng)在冰上進(jìn)行，電壓設(shè)置為100 V，進(jìn)行1 h轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，加入TBST溶液進(jìn)行清洗后，加入5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，TBST溶液清洗PVDF膜，加入一抗稀釋液(TLR4、TRAF6、NF-κB、MyD88、TRIF抗體)，4 ℃振蕩過夜，加入PBST溶液清洗3次，每次10 min，加入二抗稀釋液，室溫下孵育2 h，PBST溶液清洗后在凝膠成像儀中觀察蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié) 果

2.1 各組血清cTnT、CK-MB、MDA、SOD、TNF-α、IL-1、IL-6水平比較 與A組比較，B組血清cTnT、CK-MB、MDA、TNF-α、IL-1、IL-6水平升高，SOD水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與B組比較，C組、D組cTnT、CK-MB、MDA、TNF-α、IL-1、IL-6水平降低，SOD水平升高，且D組較C組變化明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組血清cTnT、CK-MB、MDA、SOD、TNF-α、IL-1、IL-6水平比較(±s)

與A組比較，1)P<0.05；與B組比較，2)P<0.05；與C組比較，3)P<0.05

2.2 心肌組織HE染色以及Masson染色結(jié)果 HE染色及Masson染色顯示：A組心肌組織排列較整齊，無炎性細(xì)胞浸潤；B組心肌組織出現(xiàn)較明顯炎性細(xì)胞浸潤，局部心肌細(xì)胞壞死，且出現(xiàn)較多空泡；C組心肌組織炎性細(xì)胞浸潤明顯較少，部分可見心肌細(xì)胞壞死；D組心肌組織炎性細(xì)胞浸潤基本消失，僅少部分可見炎性細(xì)胞浸潤，并未出現(xiàn)心肌細(xì)胞壞死。詳見圖1、圖2。與A組比較，B組心肌組織病理評分、心肌纖維比例升高；與B組比較，C組、D組心肌組織病理評分、心肌纖維比例降低；與C組相比，D組心肌組織病理評分、心肌纖維比例降低；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖3、圖4。

圖1 各組心肌細(xì)胞HE染色(×100)

圖2 各組心肌細(xì)胞Masson染色(×100)

與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，△P<0.05

圖3各組心肌病理組織評分比較

與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，△P<0.05

圖4各組心肌纖維比例比較

2.3 心肌細(xì)胞凋亡情況 與A組比較，B組誘導(dǎo)處理后DNA含量降低，C組經(jīng)阿那白滯素處理后DNA含量有所升高，D組細(xì)胞DNA含量升高幅度高于C組。C組、D組心肌細(xì)胞凋亡率低于B組，D組凋亡率低于C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖5、圖6。

圖5 流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞凋亡情況

與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，△P<0.05

圖6各組心肌細(xì)胞凋亡率比較

2.4 心肌組織TLR4、TRAF6、NF-κB、MyD88、TRIF mRNA、蛋白表達(dá)情況 與A組比較，B組TLR4、TRAF6、NF-κB、MyD88、TRIF mRNA、蛋白表達(dá)升高；與B組比較，C組TLR4、TRAF6、NF-κB、MyD88、TRIF mRNA、蛋白表達(dá)降低；與C組比較，D組TLR4、TRAF6、NF-κB、MyD88、TRIFmRNA、蛋白表達(dá)降低；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖7、圖8。

與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，△P<0.05

與A組比較，*P<0.05；與B組比較，#P<0.05；與C組比較，△P<0.05

3 討 論

病毒性心肌炎主要是病毒進(jìn)入心肌引發(fā)的心肌間質(zhì)炎癥反應(yīng)，其中CVB3為主要致病病毒，其進(jìn)入體內(nèi)后迅速繁殖使病人發(fā)生病毒血癥，進(jìn)而侵犯心肌間質(zhì)，刺激心肌炎癥細(xì)胞釋放大量炎癥因子，進(jìn)一步對病情進(jìn)展進(jìn)行調(diào)控。臨床上在病人發(fā)病初期給予抗病毒藥物進(jìn)行治療，但療效并不穩(wěn)定，因此尋找治療病毒性心肌炎的新型藥物十分重要[5]。阿那白滯素在臨床上廣泛用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，最近有研究報(bào)道阿那白滯素被批準(zhǔn)用于治療心肌炎[6]，為探究其作用效果與作用機(jī)制，本研究設(shè)計(jì)了一系列實(shí)驗(yàn)以期為心肌炎的治療提供新的參考。

目前許多學(xué)者均選擇小鼠進(jìn)行病毒性心肌炎模型制備，有關(guān)研究顯示BALB/c小鼠對心肌病毒靈敏性較高，心肌細(xì)胞表面具有特異性CVB3受體，在進(jìn)行接種CVB3病毒后發(fā)生心肌炎概率可達(dá)100%[7]。此外，還有研究顯示通過給小鼠注射CVB3病毒后，在飼養(yǎng)第5天可以在小鼠心臟中檢測到病毒，染色結(jié)果也顯示小鼠心肌組織發(fā)生明顯炎癥浸潤反應(yīng)[8]。關(guān)于病毒選擇方面，以往有學(xué)者采用巨噬細(xì)胞病毒建立病毒性心肌炎模型，但病毒滴度水平明顯低于CVB3病毒滴度，且重復(fù)性與穩(wěn)定性均較好[9-10]，因此，本研究選擇BALB/c小鼠作為研究對象，通過腹腔注射CVB3病毒構(gòu)建病毒性心肌炎模型。心肌組織正常新陳代謝時(shí)產(chǎn)生較多活性氧、SOD，當(dāng)心肌組織受到病毒攻擊后，病毒繁殖需要大量能量，產(chǎn)生大量氧自由基，進(jìn)而消耗大量SOD進(jìn)行清除自由基，使機(jī)體內(nèi)SOD水平迅速降低[11]，此外細(xì)胞中氧化自由基數(shù)量升高后，還能與細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸結(jié)合后生成MDA，因此測定MDA能夠反映細(xì)胞損傷程度[12]。cTnT、CK-MB主要存在于心肌中，當(dāng)心肌發(fā)生損傷后胞漿中游離的cTnT、CK-MB迅速釋放，導(dǎo)致血清中cTnT、CK-MB水平升高。有關(guān)研究顯示心肌受損后cTnT升高至原水平的10倍，CK-MB升高至原水平的5倍，兩種指標(biāo)對于心肌損傷十分敏感，在臨床上常用于病毒性心肌炎的診斷[13]。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組SOD含量降低，MDA、cTnT、CK-MB含量升高，經(jīng)阿那白滯素處理后SOD含量升高，MDA、cTnT、CK-MB含量降低，表明心肌細(xì)胞損傷與細(xì)胞過氧化能力增強(qiáng)、氧自由基清除力下降相關(guān)，給予阿那白滯素后MDA、cTnT、CK-MB水平得到改善，提示阿那白滯素能降低細(xì)胞過氧化能力，提高氧自由基清除力，進(jìn)而發(fā)揮對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。近期有研究顯示TNF-α、IL-1、IL-6與心肌病變的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[14]。國外學(xué)者研究顯示TNF-α在病毒性心肌炎感染初期，可被病毒識別作為抗原激活巨噬細(xì)胞，高水平的TNF-α能夠改變膜蛋白進(jìn)而損傷心肌[15]。國內(nèi)學(xué)者研究顯示病毒性心肌炎初期病人體內(nèi)IL-1、IL-6水平升高，使機(jī)體具有一定的防御作用，而大量表達(dá)后會加重病情的惡化[16]。本研究顯示經(jīng)阿那白滯素處理后小鼠TNF-α、IL-1、IL-6水平逐漸降低，且藥物濃度越高，TNF-α、IL-1、IL-6水平降低越明顯，表明阿那白滯素能夠抑制病毒性心肌炎所導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，并具有藥物依賴性。炎性細(xì)胞的浸潤以及心肌細(xì)胞壞死是病毒性心肌炎的主要病理特點(diǎn)[17]，本研究通過HE染色與Masson染色顯示：模型組小鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤，心肌細(xì)胞壞死、空泡；經(jīng)阿那白滯素干預(yù)后細(xì)胞浸潤、心肌細(xì)胞壞死明顯降低，這與國內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果相符[18-19]。近年來關(guān)于心肌細(xì)胞凋亡在心臟疾病中報(bào)道較多，相關(guān)研究證實(shí)病毒感染后寄生在宿主細(xì)胞內(nèi)，激活凋亡信號通路啟動凋亡體系，引發(fā)心肌細(xì)胞凋亡出現(xiàn)心肌細(xì)胞的丟失或減少[20-21]。本研究結(jié)果顯示模型組小鼠心肌細(xì)胞DNA含量明顯下降，出現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡，經(jīng)阿那白滯素干預(yù)后細(xì)胞數(shù)量有所增加，這與國內(nèi)外相關(guān)研究相符[22]。

TLRs屬于介導(dǎo)天然免疫的跨膜模式識別受體，對多種病原體均能夠識別，在免疫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用，不僅存在于內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴結(jié)、胸腺中，同時(shí)也存在于心肌細(xì)胞中[23]。TLR4是TLR家族成員之一，在機(jī)體炎癥反應(yīng)、免疫細(xì)胞成熟、分化中發(fā)揮重要作用[24]，相關(guān)研究顯示其能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、肝臟細(xì)胞或脂肪細(xì)胞表達(dá)相關(guān)炎癥因子[25]。在TLR4信號通路中，TLR4通過病毒跨膜模式識別受體后與TIR結(jié)構(gòu)域結(jié)合，如MyD88、TRIF，引起自身磷酸化后與TRAF6結(jié)合，使其發(fā)生泛素化，激活TAK復(fù)合體，進(jìn)一步激活NF-κB，激活一系列炎癥因子的表達(dá)。相關(guān)研究顯示TLR4通過激活效應(yīng)因子MyD88，進(jìn)而激活NK-κB信號通路，促進(jìn)白介素-12(IL-12)、IL-6、TNF-α等炎癥因子轉(zhuǎn)錄[26]。本研究顯示模型組大鼠TLR4、TRAF6、NF-κB、MyD88、TRIF DNA、蛋白表達(dá)量升高，經(jīng)過阿那白滯素干預(yù)后TLR4/TRAF6相關(guān)蛋白表達(dá)量均下降，表明TLR4/TRAF6信號通路參與病毒性心肌炎的發(fā)展，阿那白滯素對病毒性心肌炎的治療可能是通過下調(diào)TLR4/TRAF6相關(guān)蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

本研究也存在一定的局限性，選取的阿那白滯素濃度梯度較少，后期需要設(shè)置不同梯度的阿那白滯素濃度進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，此外并未對阿那白滯素給藥時(shí)間進(jìn)行研究，以便探究最佳治療效果。

綜上所述，阿那白滯素對病毒性心肌炎小鼠心肌組織具有保護(hù)作用，可能與抑制TLR4/TRAF6信號通路相關(guān)。