藍(lán)莓采后病害病原菌分離鑒定及其拮抗菌篩選

楊 蕾, 伍建榕, 鄧 佳, 陸燕元, 王 芳

(1.西南林業(yè)大學(xué)國(guó)家林業(yè)局西南地區(qū)生物多樣性保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2.云南省高校森林災(zāi)害預(yù)警控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3.西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

藍(lán)莓為杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vacciniumspp.)，是多年生落葉或常綠小漿果果樹.藍(lán)莓果實(shí)風(fēng)味獨(dú)特，營(yíng)養(yǎng)豐富，抗氧化活性高，被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織列為人類五大健康食品之一[1].藍(lán)莓為呼吸躍變型果實(shí)，在我國(guó)西南地區(qū)成熟于6—8月.此時(shí)高溫多雨，且采摘期集中，采后易失水，果肉軟化，造成病原菌感染而腐爛變質(zhì)[2-4]，這制約了新鮮藍(lán)莓的流通和大規(guī)模生產(chǎn)，限制了產(chǎn)業(yè)發(fā)展.因此，尋找有效預(yù)防采后病害的方法已成為當(dāng)前藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展亟待解決的問題.

利用微生物生防菌控制果蔬采后病害，能夠減少有害化學(xué)藥劑的使用，是值得深入研究的防治果蔬采后病害的方法之一[5].Mari et al[6]提出拮抗微生物可以促進(jìn)藍(lán)莓果實(shí)自身產(chǎn)生拮抗物質(zhì)并發(fā)生防御反應(yīng)，能有效防止藍(lán)莓采后病害的發(fā)生.芽孢桿菌是革蘭氏陽性桿菌，具有繁殖能力強(qiáng)、耐熱、耐酸堿、理化性質(zhì)穩(wěn)定的特點(diǎn)；其抑菌譜廣泛，大規(guī)模生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，成本較低，是目前主要的生防細(xì)菌菌株[7].許多種芽孢桿菌已被證實(shí)對(duì)果蔬病原菌具有很好的拮抗作用，將芽孢桿菌類群作為生防菌株，在果蔬生產(chǎn)中已被廣泛應(yīng)用.例如：BacillussubtilisDJM-51對(duì)番茄潰瘍病有抑菌作用[8]；BacillusamyloliquefaciensBGP20能有效控制蔬菜采后細(xì)菌性軟腐病[9]；解淀粉芽孢桿菌Bs-18對(duì)黃瓜白粉病有良好的防治效果，盆栽防治效率可達(dá)到82.22%[10].但是，有關(guān)拮抗芽孢桿菌用于藍(lán)莓采后保鮮的報(bào)道較少，僅 Kurniawan et al[11]研究了芽孢桿菌和假單胞菌屬真菌對(duì)藍(lán)莓果實(shí)灰霉病和鏈格孢霉的控制作用.本研究在對(duì)藍(lán)莓果實(shí)采后貯藏過程中引起腐爛病的病原菌進(jìn)行分離鑒定的基礎(chǔ)上，從健康藍(lán)莓果實(shí)、葉片及根際土壤中分離、篩選拮抗芽孢桿菌，測(cè)定其對(duì)藍(lán)莓采后病害的生防效果，為藍(lán)莓采后病害的生物防治及新型生物農(nóng)藥的開發(fā)提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 樣本采集

于云南省昆明市盤龍區(qū)西南林業(yè)大學(xué)大棚種植基地內(nèi)，分別采集18份藍(lán)莓健康果實(shí)及9份葉片和根際土壤.其中，9份藍(lán)莓果實(shí)置于室溫下待其自然發(fā)病，用于病原真菌的分離；另外9份藍(lán)莓果實(shí)和葉片、根際土壤分裝于無菌封口袋內(nèi)，做好標(biāo)記并存放于4 ℃冰箱中，用于拮抗菌株的分離.

1.2 病原菌的分離與鑒定

采用組織分離法分離病原菌.在無菌環(huán)境下切取發(fā)病部位組織，用75%酒精表面消毒5 s后，用無菌水沖洗3次，置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂糖(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基中央.每份標(biāo)本設(shè)置5個(gè)重復(fù)，25 ℃培養(yǎng)3～5 d，記錄菌株生長(zhǎng)情況.當(dāng)菌落直徑生長(zhǎng)至約1 cm時(shí)，進(jìn)行純化保存?zhèn)溆?通過顯微形態(tài)觀察[12]鑒定病原真菌.

1.3 病原菌致病性檢測(cè)

采用有傷接種法，將分離所得病原菌回接至健康藍(lán)莓果實(shí).選取健康藍(lán)莓果實(shí)，在無菌環(huán)境下先用無菌水將其表面灰塵沖洗干凈，再用75%酒精表面消毒5 s，后用無菌水沖洗3次，晾干.用滅菌竹簽將藍(lán)莓果實(shí)表面刺3個(gè)微孔(孔眼分散)，調(diào)配病原菌菌液濃度至104、105、106、107CFU·mL-1[13]，分別將菌液接種至傷口處，置于室溫條件下，定期觀察果實(shí)發(fā)病情況.

1.4 拮抗芽孢桿菌的分離與鑒定

1.4.1 根際土壤樣品菌株的分離 采取土壤稀釋分離法對(duì)根際土壤樣品的菌株進(jìn)行分離.稱取10 g土樣，放入裝有90 mL無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，置于200 r·min-1的搖床上振蕩30 min，制成初始土壤懸浮液.在無菌操作臺(tái)內(nèi)使用無菌水稀釋至10-4、10-5、10-6和10-74個(gè)梯度，取200 μL各濃度菌液分別涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂(nutrient agar，NA)培養(yǎng)基.每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)，37 ℃培養(yǎng)2～3 d，記錄菌株生長(zhǎng)情況，挑取形態(tài)差異明顯的單個(gè)菌落純化后保存?zhèn)溆?

1.4.2 果實(shí)及葉片樣品菌株的分離 將藍(lán)莓果實(shí)和葉片樣品分裝于盛有30 mL的0.05 mol·L-1磷酸緩沖液離心管中，將其放在100 r·min-1搖床上振蕩20 min.然后在無菌操作臺(tái)內(nèi)將緩沖液依次稀釋至10-1和10-2，吸取各濃度菌液200 μL到NA培養(yǎng)基上.每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)，37 ℃培養(yǎng)2～3 d，記錄菌株生長(zhǎng)情況，挑取形態(tài)差異明顯的單個(gè)菌落純化后保存?zhèn)溆?

1.4.3 供試菌株的初步鑒定 將上述分離純化得到的供試菌株進(jìn)行DNA提取，然后選用引物P1和P6[14]進(jìn)行16S rRNA基因序列擴(kuò)增.擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)得的序列通過DNAMAN軟件進(jìn)行拼接，將拼接好的序列利用MEGA 6.0軟件進(jìn)行聚類分析，進(jìn)而初步鑒定出所分離的菌株.

1.5 抑制病原真菌活性試驗(yàn)

選取從藍(lán)莓果腐病上分離得到的病原真菌，接種到PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5 d后，在菌落邊緣用打孔器打取6 mm菌餅，放至新的PDA培養(yǎng)基中間，同時(shí)取6 mm無菌濾紙片放在距其3 cm的4個(gè)位置，加入5 μL拮抗細(xì)菌菌懸液(菌懸液的濃度為107CFU·mL-1).以無菌水作為對(duì)照，3個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)5 d后觀察抑菌效果，計(jì)算抑菌率.采用 SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，并用單因素方差分析的LSD法進(jìn)行差異顯著性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓采后病原菌的分離與鑒定

通過對(duì)藍(lán)莓果實(shí)采后表面病原菌的分離和純化得到8株真菌.經(jīng)顯微形態(tài)觀察明確了其中2株致病菌，分別為青霉菌(Penicilliumdigitatum)(圖1A、1B)和枝孢菌(Cladosporiumtenuiussimum)(圖1C、1D).

A、B分別為P.digitatum菌落形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)特征；C、D分別為C.tenuiussimum菌落形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)特征.圖1 藍(lán)莓采后病原真菌菌落形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)特征Fig.1 Colony morphology and microstructure characteristics of pathogenic fungi isolated from rotten blueberry in post-harvest

P.digitatum形態(tài)特征：指狀青霉屬半知菌類，分生孢子梗較粗短，(60～130) μm×(5～7) μm，帚狀分枝頂端往往二輪生，瓶梗3～5個(gè)，分生孢子串生、橢圓形、無色，(6～8) μm×(2.5～5.0) μm.

C.tenuiussimum形態(tài)特征：正極細(xì)枝孢半知菌類，分生孢子梗暗色，在頂部或中部分枝，分生孢子暗色，1～2個(gè)細(xì)胞，形狀和大小不一.

2.2 藍(lán)莓采后病原菌致病性檢測(cè)結(jié)果

將分離到的真菌回接至健康藍(lán)莓果實(shí)，在室溫條件下，第5天時(shí)接種青霉菌的藍(lán)莓果實(shí)表面出現(xiàn)綠色霉層，整個(gè)果實(shí)腐爛變質(zhì)；接種枝孢菌的藍(lán)莓果實(shí)表面出現(xiàn)白色霉層，整個(gè)果實(shí)也已經(jīng)變質(zhì)；而對(duì)照組未見明顯癥狀(圖2).

A、C為對(duì)照組；B為接種P.digitatum的發(fā)病果實(shí)；D為接種C.tenuiussimum的發(fā)病果實(shí).圖2 藍(lán)莓采后病原真菌回接發(fā)病癥狀Fig.2 Infective symptoms of blueberry inoculated with P.digitatum and C.tenuiussimum

2.3 拮抗菌的分離與鑒定

從健康藍(lán)莓的果實(shí)、葉片和根部土壤中，共分離獲得17株菌.其中，葉片中分離出2株，果實(shí)中分離出7株，根際土壤中分離出8株.對(duì)這些菌株進(jìn)行16S rRNA序列擴(kuò)增，結(jié)果見圖3.

BF.藍(lán)莓果實(shí)；BL.藍(lán)莓葉片；BS.藍(lán)莓根際土壤；CK.對(duì)照水；MK.100 bp DNA marker.圖3 17株分離菌的16S rRNA基因擴(kuò)增電泳圖Fig.3 Electrophoresis of 16S rRNA gene from 17 isolated strains

利用MAGE 6.0軟件，采用鄰接法對(duì)測(cè)定的序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4).結(jié)果表明，菌株BS-8和BF-4與Brevibacillus的菌株聚在一起，屬于Brevibacillus.其中，菌株BS-8與B.brevisNBRC 15304(T)和B.panacihumiDCY35(T)的序列相似性分別為98.73%和96.77%；菌株BF-4與B.borstelensisNRRL NRS-818(T)的序列相似性為99.93%.菌株BF-1屬于Paenibacillus，其與P.dendritiformisCIP 105967(T)、P.popilliaeATCC14706(T)、P.thiaminolyticusNBRC 15656(T)的序列相似性分別為99.44%、98.10%、98.38%.菌株BS-4屬于Staphylococcus，其與S.epidermidisATCC 14990(T)、S.capraeATCC 35538(T)、S.capitisATCC 27840(T)的序列相似性分別為98.88%、98.33%、98.47%.菌株BS-3、BF-5和BS-1屬于Bacillus.其中，BS-3與B.paralicheniformisKJ-16(T)的序列相似性為99.44%；BF-5與B.velezensisCR-502(T)的序列相似性為96.48%；BS-1與B.subtilissubsp.inaquosorumKCTC 13429(T)和B.velezensisCR-502(T)的序列相似性分別為99.02%和99.13%.BF-3屬于Rhodococcus，其與R.enclensisNIO-1009(T)和R.trifoliiT8(T)的序列相似性分別為99.34%和98.83%.BF-2屬于Kocuria，其與K.indicaNIO-1021(T)、K.salsicia104(T)、K.marinaKMM 3905(T)的序列相似性分別為98.57%、97.80%、99.16%.BL-1、BL-2屬于Bacillus.BS-2、BS-7、BS-6、BF-7屬于Pseudomonas.BF-6屬于Flavobacterium，與F.acidificumLMG 8364(T)的序列相似性為99.57%.BS-5屬于Enterobacter，其與E.tabaciYIM Hb-3(T)和E.muelleriJM-458(T)的序列相似性分別為99.02%和99.01%.

圖4 基于16S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rRNA genes

2.4 拮抗菌的篩選

抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果表明，從健康藍(lán)莓果實(shí)、葉片及根際土壤中分離出的細(xì)菌對(duì)藍(lán)莓采后的2種病原真菌有不同程度的抑制效果.其中，5株菌(BS-1、BS-3、BS-8、BF-4、BF-5)對(duì)P.digitatum有顯著的抑制效果，抑菌率分別為87.6%、90.6%、78.6%、68.7%、67.6%(表1).由圖4可知，其中3株為芽孢桿菌(Bacillus)，2株為短芽孢桿菌(Brevibacillus).3株菌(BS-3、BS-8、BF-4)對(duì)C.tenuiussimum有顯著的抑制效果，抑菌率分別為90.7%、92.6%、91.5%(表1).其中，菌株BS-3對(duì)P.digitatum和C.tenuiussimum的抑制率都在90%以上.

表1 健康藍(lán)莓果實(shí)、葉片及根際土壤分離菌株對(duì)2種藍(lán)莓病原菌的抑制結(jié)果1)Table 1 Control efficacy of strains isolated from healthy blueberry fruit, leaf and rhizosphere soil on P.digitatum and C.tenuiussimum

1)同列數(shù)據(jù)后附不同大、小寫字母者分別表示在0.01、0.05水平上差異顯著，附相同大、小寫字母者分別表示在0.01、0.05水平上差異不顯著.

3 討論

本研究分離得到的引起藍(lán)莓果實(shí)采后病害的青霉菌和枝孢菌，與周笑犁等[3]報(bào)道的貴州藍(lán)莓采后病原真菌基本一致，說明青霉菌和枝孢菌是引起我國(guó)西南地區(qū)藍(lán)莓采后病害的常見病原真菌.本研究還獲得了對(duì)青霉菌和枝孢菌有顯著抑制活性的多個(gè)芽孢桿菌菌株，其中BS-3菌株對(duì)青霉菌和枝孢菌的抑制率都達(dá)到了90%以上.BS-3菌株的16S rRNA序列與BacillusparalicheniformisKJ-16的同源性達(dá)99.44%，可以認(rèn)為是同種的不同株系.Wang et al[15]曾報(bào)道BacillusparalicheniformisMDJK30對(duì)牡丹根腐病菌有拮抗作用.本研究證明菌株BS-3在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)藍(lán)莓采后的2種病原菌具有較好的抑制效果，今后將進(jìn)一步對(duì)其拮抗機(jī)理以及生產(chǎn)應(yīng)用的安全性和持久性等進(jìn)行深入研究.