磷脂酰膽堿特異性和磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C酶學(xué)性質(zhì)及其在油脂脫膠中的應(yīng)用

鄒 權(quán)，陳 圣，嚴(yán) 明

(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京211800)

酶法脫膠作為近幾年發(fā)展起來(lái)的新型的植物油脫膠技術(shù)，相對(duì)于其他傳統(tǒng)脫膠工藝，如水化脫膠、酸法脫膠、膜法脫膠[1]、Top脫膠、吸附脫膠[2-3]、超濾脫膠[4-5]和超臨界CO2脫膠[6]等，具有適應(yīng)性強(qiáng)、節(jié)能高效、綠色環(huán)保、中性油損失少，還能增加油脂得率等優(yōu)點(diǎn)。酶法脫膠的原理主要是利用磷脂酶將毛油中的非水合磷脂水解掉一個(gè)脂肪酸生成溶血磷脂，溶血磷脂具有良好的親水性，可以通過(guò)簡(jiǎn)單的水化方法去除。根據(jù)作用于磷脂不同位點(diǎn)可以將磷脂酶分為磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶B、磷脂酶C和磷脂酶D。其中，磷脂酶A1和磷脂酶A2分別水解磷脂Sn-1和Sn-2位的酯鍵生成溶血磷脂和脂肪酸；磷脂酶B則具有水解Sn-1和Sn-2位酯鍵的特性；磷脂酶C催化水解Sn-3位酯鍵，生成甘油二酯(DAG)和磷酸化合物；磷脂酶D則作用于磷酸和極性基團(tuán)之間的磷酸單酯鍵。而根據(jù)磷酸基團(tuán)上取代基-X的不同，磷脂又分為磷脂酸(PA)、磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)和磷脂酰肌醇(PI)等[7]。

磷脂酶C主要作用于磷脂分子Sn-3?；稽c(diǎn)，水解磷脂得到甘油二酯和有機(jī)磷酸酯(磷酸膽堿、磷酸肌醇、磷酸乙醇胺和磷酸絲氨酸等)。其中，甘油二酯屬于油脂的正常組分，甘油二酯的產(chǎn)生不但不會(huì)影響精煉油脂的品質(zhì)，還能增加精煉油脂得率。而且，磷脂酶C水解磷脂后不會(huì)產(chǎn)生游離脂肪酸(FFA)，不會(huì)增加油脂的酸值，從而不影響油脂下游的精煉工藝和最終產(chǎn)品的質(zhì)量[8]。

早在1988年，Graille等[9]就曾提出將磷脂酶C用于油脂脫膠，但受限于當(dāng)時(shí)的高成本及酶制備技術(shù)不成熟等原因沒(méi)有將其應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。隨著商品植物油的價(jià)格持續(xù)上漲，油脂市場(chǎng)將注意力轉(zhuǎn)到了磷脂酶C。與此同時(shí)，一些與磷脂酶C有關(guān)的脫膠工藝的專利[10]的出現(xiàn)促進(jìn)了磷脂酶C在油脂脫膠領(lǐng)域的商業(yè)化[11]。最早的商業(yè)化磷脂酶C是Verenium公司在2008年American Oil Chemists’ Society(AOCS)年會(huì)上推出的Purifine?(PLC)，也是目前工藝最為成熟的PLC脫膠產(chǎn)品，將該產(chǎn)品應(yīng)用于大豆油脫膠中，每降低500 mg/kg的磷脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)，精煉油脂得率就提高1%[12]。近幾年，國(guó)內(nèi)對(duì)磷脂酶C的相關(guān)研究逐漸增加。如江南大學(xué)王興國(guó)課題組先后在單增李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)[13]、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)[14]和金黃色葡萄球菌(Staphylococusaureus)[15]等菌中發(fā)現(xiàn)并克隆表達(dá)了這些磷脂酶C基因，并將其初步應(yīng)用于植物油脫膠中，取得了良好的效果。但是目前所報(bào)道的磷脂酶C基因大部分都是PC或PE特異性，不具備水解PI和PA的功能。而PC和PE占大豆油或菜籽油中總磷脂的55%～77%，PI占大豆油中總磷脂的20%～24%[16]。這對(duì)于處理高磷含量的毛油來(lái)說(shuō)不足以使脫膠油中磷含量達(dá)到一個(gè)較低的水平。

筆者通過(guò)基因組數(shù)據(jù)挖掘的方法，篩選到了2條分別具有PC、PE特異性磷脂酶C活性和PI特異性磷脂酶C活性的基因，并將其構(gòu)建至枯草芽孢桿菌中進(jìn)行分泌表達(dá)，并將其應(yīng)用于植物油脫膠領(lǐng)域。本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)這2條磷脂酶C基因的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征并對(duì)它們?cè)谟椭撃z中的性能進(jìn)行研究，以期在油脂脫膠領(lǐng)域做出新的探索。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

蠟狀芽孢桿菌，中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。載體質(zhì)粒PMA5，優(yōu)寶生物?？寺∷拗鱁.coliDH5α和表達(dá)宿主枯草芽孢桿菌(Bacillussublitis)WB800保藏于南京工業(yè)大學(xué)基因工程與生物信息學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 儀器與試劑

各種限制性內(nèi)切酶、Prime STAR HS DNA聚合酶、T4 DNA連接酶，寶生物工程(大連)有限公司；細(xì)菌基因組試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；PCR引物合成，南京金斯瑞生物科技有限公司?？股?、考馬斯亮藍(lán)、牛血清蛋白(BSA)及其余試劑，生工生物工程(上海)股份有限公司。

5804R型高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf公司。粗制大豆油(初始磷含量531 mg/kg)，中糧集團(tuán)有限公司。

1.3 PC、PE特異性磷脂酶C和PI特異性磷脂酶C在枯草芽孢桿菌中的克隆表達(dá)

通過(guò)查閱文獻(xiàn)資料及序列比對(duì)，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)得到1條來(lái)源于蠟狀芽孢桿菌的PC、PE特異性磷脂酶C基因序列(GenBank:WP017149985.1)并設(shè)計(jì)引物。上游引物：5′-GGAATTCCATATGAAAAAGAAAGTGTT-3′,下游引物：5′-CGGGATCCTTAGCGATTTCCGTATGTAT-3′(上下游引物分別引入NdeⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)，劃線處為酶切位點(diǎn))。具有PI特異性磷脂酶C基因序列(GenBank:WP047338113.1)通過(guò)南京金斯瑞生物科技有限公司合成(在序列上下游分別引入NdeⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn))。將獲得的PC-PLC、PI-PLC以及質(zhì)粒PMA5使用NdeⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，用T4 DNA連接酶連接并轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)。挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序，將測(cè)序正確的轉(zhuǎn)化子擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒PMA5-PCPLC以及PMA5-PIPLC電轉(zhuǎn)至表達(dá)宿主枯草芽孢桿菌WB800(電轉(zhuǎn)參數(shù)：電壓2.0 kV，電容25 μF，電阻200 Ω)[17]。挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的重組菌命名為B.sublitis/PMA5-PCPLC以及B.sublitis/PMA5-PIPLC。挑取重組菌單菌落，接種于含有30 mg/mL的卡那霉素抗性的5 mL液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、200 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)12 h。將培養(yǎng)12 h的菌液以體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接入含有30 mg/mL的卡那霉素抗性的100 mL液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、200 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h后停止培養(yǎng)。用高速冷凍離心機(jī)將培養(yǎng)液離心分離，收集上清備用。

1.4 PC-PLC與PI-PLC粗酶液的制備及蛋白濃度測(cè)定

將重組菌發(fā)酵培養(yǎng)后所得上清液經(jīng)過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀、透析除鹽所得酶液即為粗酶液。粗酶液蛋白濃度測(cè)定采用常規(guī)Bradford法測(cè)定[18]。

考馬斯亮藍(lán)G-250標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液：取10 mg牛血清蛋白，用蒸餾水定容至100 mL，配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白液。

考馬斯亮藍(lán)G-250溶液：取50 mg考馬斯亮藍(lán)G-250，加入25 mL 90%的乙醇溶液及85%磷酸溶液50 mL，定容至500 mL。

將標(biāo)準(zhǔn)蛋白液稀釋成10、20、40、60、80及100 μg/mL的蛋白濃度梯度溶液，分別取1 mL放入10 mL試管中，每管加入5 mL考馬斯亮藍(lán)試劑，混勻，靜置5 min，于595 nm測(cè)定其吸光值A(chǔ)595。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量(mg)為橫坐標(biāo)、吸光度值A(chǔ)595為縱坐標(biāo)作圖，即得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。由此標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測(cè)出的未知樣品的A595，即可獲得未知樣品的蛋白濃度。

1.5 PC-PLC與PI-PLC粗酶液酶學(xué)性質(zhì)研究

酶活單位定義：每分鐘催化水解磷脂生成1mmol/L甘油二酯所需的酶量為1個(gè)酶活單位(U)。

甘油二酯含量檢測(cè)方法參照AOCS官方方法 Cd 11d-96[19]。

1.5.1 PC-PLC與PI-PLC的最適溫度及溫度穩(wěn)定性

將反應(yīng)體系分別在25～65 ℃條件下進(jìn)行反應(yīng)。以酶活最高為100%，其余酶活與之相比，計(jì)算其相對(duì)酶活，研究酶的最適溫度。

將粗酶液放置在25～65 ℃條件下保溫2 h，檢測(cè) 2 h后的殘余酶活。以未保溫條件下酶活為100%，計(jì)算保溫后的相對(duì)酶活，研究酶的溫度穩(wěn)定性。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.5.2 PC-PLC與PI-PLC的最適pH及pH穩(wěn)定性

分別配制pH為4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和9.0的緩沖液，在不同的pH緩沖液條件下檢測(cè)酶的活性，確定最適pH。

將粗酶液加入到不同pH的緩沖液溶液中，檢測(cè)2 h后的殘余酶活。以各pH下未處理酶液酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，研究酶的pH穩(wěn)定性。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.5.3 金屬離子對(duì)PC-PLC與PI-PLC酶活力影響

以不加金屬離子反應(yīng)體系中所測(cè)得酶活為100%，檢測(cè)反應(yīng)體系中加入了1 mmol/L的Mg2+、Ca2+、Zn2+、Fe3+、Mn2+、K+、Co2+和Ba2+后的酶活力，并計(jì)算相對(duì)酶活。

1.6 PC-PLC與PI-PLC用于大豆油酶法脫膠

1.6.1 脫膠方法

準(zhǔn)確稱取100 g大豆毛油于500 mL燒杯中，水浴加熱到80 ℃，在燒杯中加入0.15 mL 45%檸檬酸溶液，10 000 r/min充分混勻1 min，然后在500 r/min、80 ℃條件下反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后使混合物降到適當(dāng)溫度，加入適量的4%NaOH溶液調(diào)節(jié)至所需pH，然后加入200 g/L的水以及適量的酶液，在10 000 r/min攪拌速度下充分混勻后，于所需條件下進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后在90 ℃條件下加熱10 min使酶失活，然后12 000 r/min離心10 min，取上層油樣進(jìn)行磷含量和甘油二酯含量的測(cè)定。

磷含量測(cè)定參照GB/T 5537—2008；甘油二酯含量測(cè)定則按照AOCS官方方法Cd 11d-96。

1.6.2 油相pH的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取40 g經(jīng)過(guò)檸檬酸預(yù)處理的油水混合物于50 mL離心管中，在5 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，去掉上層油相，然后向離心管中加入5 mL水，充分混勻后再次5 000 r/min離心10 min，取水相進(jìn)行pH測(cè)定。最終所測(cè)油相pH的經(jīng)驗(yàn)校正公式：實(shí)際pH=測(cè)量pH-0.3[20]。

1.6.3 不同脫膠條件對(duì)PC-PLC與PI-PLC脫膠效果的影響

在脫膠試驗(yàn)中，分別考察不同的脫膠溫度、pH、酶添加量和反應(yīng)時(shí)間對(duì)PC-PLC與PI-PLC單獨(dú)使用脫膠效果的影響，以脫膠油中磷含量作為考察指標(biāo)。每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，取3次結(jié)果平均值作為最終結(jié)果。

1.6.4 PC-PLC與PI-PLC聯(lián)合脫膠效果的研究

由于油脂中磷脂的主要成分是PA、PC、PE和PI，單獨(dú)使用PC-PLC或PI-PLC用于油脂脫膠，脫膠效果很難達(dá)到物理精煉的要求。因此，本實(shí)驗(yàn)將PC-PLC和PI-PLC聯(lián)合用于脫膠試驗(yàn)中的脫膠效果進(jìn)行研究。

2 結(jié)果與討論

2.1 PC-PLC和PI-PLC在枯草芽孢桿菌中的克隆表達(dá)結(jié)果

根據(jù)PC-PLC的基因序列設(shè)計(jì)引物，將PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知：在近900 bp處有特異性擴(kuò)增條帶，其大小與預(yù)期基本一致(目的條帶約為852 bp)。挑取陽(yáng)性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中目的序列一致。重組菌B.sublitis/PMA5-PCPLC以及B.sublitis/PMA5-PIPLC表達(dá)蛋白的SDS-PAGE電泳見(jiàn)圖2。

由圖2可知，PC-PLC和PI-PLC表達(dá)的重組蛋白與預(yù)測(cè)的酶蛋白分子量基本一致(PC-PLC約為3.0×104，PI-PLC約為3.2×104)。將發(fā)酵所得上清分別經(jīng)過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀和透析袋除鹽后用Bradford法測(cè)定粗酶液蛋白濃度，所測(cè)得PC-PLC和PI-PLC粗酶液蛋白質(zhì)量濃度分別為0.8 mg/mL和0.5 mg/mL。

M為標(biāo)準(zhǔn)DNA；1為PC-PLC的PCR結(jié)果圖1 PC-PLC基因PCR結(jié)果Fig.1 PCR analysis of PC-PLC

M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1為PI-PLC；2為PC-PLC；3為WB800空菌對(duì)照?qǐng)D2 PC-PLC和PI-PLC表達(dá)結(jié)果Fig.2 SDS-PAGE analysis of PC-PLC and PI-PLC

2.2 PC-PLC和PI-PLC粗酶液酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果

2.2.1 最適溫度和溫度穩(wěn)定性

PC-PLC和PI-PLC最適溫度和溫度穩(wěn)定性見(jiàn)圖3。

由圖3可知：PC-PLC和PI-PLC的最適溫度分別為45 ℃和40 ℃，并且這2種酶在30～50 ℃范圍內(nèi)酶活均能達(dá)到60%以上。

在30～45 ℃范圍內(nèi)保溫2 h后，PC-PLC和PI-PLC都能保持60%以上活性。說(shuō)明這2種酶的溫度穩(wěn)定性較好，有應(yīng)用價(jià)值。

圖3 溫度對(duì)PC-PLC和PI-PLC活性和穩(wěn)定性影響Fig.3 Effects of temperature on activity and stability of PC-PLC and PI-PLC

2.2.2 最適pH和pH穩(wěn)定性

PC-PLC和PI-PLC最適pH和pH穩(wěn)定性見(jiàn)圖4。

圖4 pH對(duì)PC-PLC和PI-PLC活性和穩(wěn)定性影響Fig.4 Effects of pH on activity and stability of PC-PLC and PI-PLC

由圖4可以看到，這2種酶的最適pH分別為6.0和7.0。在pH為6.0～7.0時(shí)，2種酶的穩(wěn)定性都較好，2 h后剩余酶活仍在60%以上。當(dāng)pH超過(guò)7.0，酶的穩(wěn)定性下降比較明顯，而在偏酸性條件下酶活穩(wěn)定性較好，說(shuō)明這2種磷脂酶在中性偏酸的條件下有較好的耐受性。

2.2.3 金屬離子對(duì)酶活力影響研究

金屬離子對(duì)PC-PLC和PI-PLC酶活性影響結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5可知：Mg2+和Zn2+對(duì)PC-PLC活性有較大的促進(jìn)作用；而Ca2+則對(duì)PI-PLC活性有較大促進(jìn)作用，Mg2+同樣對(duì)其活性有促進(jìn)作用，但不如Ca2+明顯。其余金屬離子對(duì)PC-PLC和PI-PLC的促進(jìn)或抑制作用均不是很顯著。

圖5 金屬離子對(duì)PC-PLC和PI-PLC酶活的影響Fig.5 Effects of metal ions on activity of PC-PLC and PI-PLC

2.3 PC-PLC和PI-PLC在不同條件下脫膠效果研究

2.3.1 溫度對(duì)脫膠效果影響

在脫膠過(guò)程中，溫度的高低對(duì)脫膠效果有著重要的影響。在pH 6.5、酶添加量60 mg/kg和反應(yīng)2 h條件下分別對(duì)PC-PLC和PI-PLC在40、45、50、55、60和65 ℃溫度下的脫膠效果進(jìn)行研究，結(jié)果如圖6所示。

圖6 溫度對(duì)脫膠的影響Fig.6 Effects of temperature on degumming

從圖6(a)可以看出，當(dāng)溫度在40～50 ℃之間時(shí)，隨著溫度升高，脫膠油中磷含量隨之降低；而當(dāng)溫度高于50 ℃，磷含量逐漸升高，可能是由于溫度的升高導(dǎo)致酶活性逐漸下降，從而降低脫膠效果，PC-PLC的最佳脫膠溫度為50 ℃。圖6(b)表明PI-PLC在溫度為45 ℃時(shí)脫膠效果最佳，當(dāng)溫度高于45 ℃，隨著溫度的上升，脫膠油中磷含量也在增加。由此可見(jiàn)，PC-PLC的最佳脫膠溫度高于PI-PLC的最佳脫膠溫度

2.3.2 pH對(duì)脫膠效果影響

pH在脫膠過(guò)程中也是1個(gè)十分重要的影響因素。在45 ℃、酶添加量60 mg/kg、反應(yīng)2 h條件下分別考察PC-PLC和PI-PLC在pH 4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0條件下的脫膠效果，結(jié)果如圖7所示。

從圖7可以看到，PC-PLC和PI-PLC的最佳脫膠pH分別為6.0和7.0，與它們的最適pH及pH穩(wěn)定性結(jié)果基本一致。PC-PLC與PI-PLC在pH 6.0～7.0范圍內(nèi)的脫膠效果均較好，而在該范圍之外的pH條件下，脫膠油中磷含量則開(kāi)始上升，說(shuō)明過(guò)酸或者過(guò)堿條件均不利于這2個(gè)酶的脫膠反應(yīng)。

圖7 pH對(duì)脫膠的影響Fig.7 Effects of pH on degumming

2.3.3 酶添加量對(duì)脫膠效果影響

在脫膠試驗(yàn)中，酶添加量過(guò)高會(huì)形成酶的過(guò)量，造成酶浪費(fèi)；而酶添加量過(guò)低則會(huì)使的脫膠效果不佳。因此，需要對(duì)酶添加量進(jìn)行優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)在45 ℃、pH 6.5、反應(yīng)2 h條件下，分別在脫膠體系中添加20、40、60、80、100和120 mg/kg的酶量，考察不同酶添加量條件下的脫膠效果，結(jié)果如圖8所示。

圖8 酶添加量對(duì)脫膠的影響Fig.8 Effects of enzyme dosage on degumming

由圖8可以發(fā)現(xiàn):隨著脫膠體系中初始酶量增加，脫膠油中磷含量降低幅度較大；當(dāng)PC-PLC添加量達(dá)到80 mg/kg時(shí)，繼續(xù)增加酶量，磷含量降低十分緩慢，基本保持不變，說(shuō)明在80 mg/kg的酶添加量情況下，油脂中PC和PE基本被完全水解。而PI-PLC的添加量在超過(guò)60 mg/kg后脫膠油中磷含量就基本保持不變，說(shuō)明在該酶量添加條件下油脂中PI基本被水解完全。考慮到酶的成本的原因，PC-PLC和PIP-PLC分別選擇80 mg/kg和60 mg/kg的酶添加量為最佳添加量。

2.3.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)脫膠效果的影響

在pH 6.5、45 ℃、酶添加量為60 mg/kg油的條件下，分別考察不同脫膠時(shí)間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h)對(duì)PC-PLC和PI-PLC脫膠效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 反應(yīng)時(shí)間對(duì)脫膠的影響Fig.9 Effects of reactiontime on degumming

由圖9可知：在脫膠時(shí)間為0～1 h時(shí)，磷含量急劇下降，這是由于對(duì)油脂進(jìn)行酸的預(yù)處理過(guò)程中，檸檬酸將油脂中的一些非水化磷脂轉(zhuǎn)化成水化磷脂，而水化磷脂具有相對(duì)較好的水化作用，在后續(xù)的離心過(guò)程中存在于水相從而被去除。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)2 h后，磷含量的降低極為緩慢，2.5 h后脫膠油中磷含量基本保持不變，考慮到2h基本上水解過(guò)程達(dá)到平衡且反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)造成生產(chǎn)成本的增加，因此，選擇2 h為最佳脫膠反應(yīng)時(shí)間。

綜上所述，得到PC-PLC的最適脫膠條件為50 ℃、pH 6.0、反應(yīng)2 h、酶添加量為80 mg/kg；PI-PLC的最適脫膠條件為45 ℃、pH 7.0、反應(yīng)2 h、酶添加量為60 mg/kg。

2.4 PI-PLC與PC-PLC組合使用脫膠效果

根據(jù)2.3節(jié)不同條件對(duì)PC-PLC和PI-PLC脫膠效果的影響的結(jié)果設(shè)計(jì)如下幾組實(shí)驗(yàn)方案來(lái)比較聯(lián)合使用用于處理大豆毛油的脫膠效果，每組試驗(yàn)進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，取3次實(shí)驗(yàn)平均值作為最終結(jié)果。實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可以看出：在對(duì)大豆毛油進(jìn)行脫膠試驗(yàn)中，PC-PLC與PI-PLC聯(lián)合使用可以達(dá)到很好的脫膠效果，脫膠后的磷含量除4號(hào)實(shí)驗(yàn)都達(dá)到了物理精煉要求，而單酶脫膠效果則沒(méi)能達(dá)到要求；在1號(hào)實(shí)驗(yàn)條件下最終磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.1 mg/kg，在對(duì)油脂中甘油二酯變化量進(jìn)行測(cè)定后發(fā)現(xiàn)甘油二酯增加量達(dá)到0.95%。對(duì)比4組組合實(shí)驗(yàn)脫膠結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在1號(hào)條件(PC-PLC最適脫膠條件)下脫膠效果最好，這可能是因?yàn)橛椭蠵C、PE的含量大于PI含量，所以在PC-PLC最適脫膠條件脫膠效果要優(yōu)于其他條件。

表1 不同脫膠條件下磷含量和甘油二酯增加量

3 結(jié)論

筆者成功將分別具有PC、PE特異性和PI特異性的磷脂酶C基因克隆至枯草芽孢桿菌WB800并進(jìn)行胞外分泌表達(dá)。對(duì)PC-PLC和PI-PLC粗酶液進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)研究，包括最適溫度和溫度的穩(wěn)定性、最適pH和pH穩(wěn)定性、金屬離子的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這2種磷脂酶C均具有較好的溫度和pH耐受性。其中PC-PLC和PI-PLC最適溫度分別為45 ℃和40 ℃，并且在30～45 ℃范圍內(nèi)保溫2 h后剩余酶活仍在60%以上；PC-PLC和PI-PLC最適pH分別為6.0和7.0，在pH為6.0～7.0時(shí)，2種酶都具有較高的穩(wěn)定性，保溫2h后剩余酶活在60%以上。金屬離子影響研究中發(fā)現(xiàn)Mg2+和Zn2+對(duì)PC-PLC活性有較大的促進(jìn)作用；而Ca2+則對(duì)PI-PLC活性有較大促進(jìn)作用。

在進(jìn)行的植物油脫膠研究實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不同的反應(yīng)溫度、pH、反應(yīng)時(shí)間和酶添加量對(duì)脫膠效果影響也不同。在將PC-PLC和PI-PLC組合，共同用于油脂脫膠中發(fā)現(xiàn)，該組合脫膠效果相較于單個(gè)酶使用效果有很大的提升，在50 ℃、pH 6.0、反應(yīng)2 h、PC-PLC和PI-PLC初始粗酶液添加量分別為80 mg/kg和60 mg/kg時(shí)，脫膠油中磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)降至4.1 mg/kg，完全達(dá)到后續(xù)物理精煉所需要求，并且油脂得率增加0.95%。以上這些研究為磷脂酶C在油脂脫膠領(lǐng)域做出了新的探索，并為以后工業(yè)化應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。