大豆渣提取L-阿拉伯糖及輔助玉米秸稈酶解液發(fā)酵產乙醇的研究

曾杜文，牛亞平，徐麗麗，張繼祥，易 勇，李洪興，*，鮑曉明，

（1.齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室，山東 濟南 250353；2.山東大學 微生物技術國家重點實驗室，山東 青島 266237；3.山東圣琪生物有限公司，山東 濟寧 273517）

大豆是重要的副食品及工業(yè)原料，其加工業(yè)已經形成比較完整的產業(yè)鏈條，相關產品涉及營養(yǎng)保健、飼料加工、包裝、化工、環(huán)保、醫(yī)藥等諸多領域，具有廣闊的發(fā)展前景[1]。與此同時，大量的生物質“廢棄物”也在上述產品加工過程中產生。典型代表是提取油脂及蛋白質后的殘渣即大豆渣（soybean dregs）[2]，其富含膳食纖維（60%～70%）、蛋白質（13%～20%）、脂肪（6%～19%）及微量元素等成分[3-4]。然而，由于新鮮豆渣含水量大、運輸困難且易腐敗變質，主要被就近用作動物飼料、肥料或直接被丟棄，導致了資源浪費、企業(yè)經濟效益降低而且嚴重影響了環(huán)境。為此，實現大豆渣綜合利用、深入開發(fā)其高附加值組分和營養(yǎng)成分已成為當今研究的熱點和趨勢。

大豆渣中的糖分主要存在于纖維素、半纖維素及可溶性大豆多糖中，其中L-阿拉伯糖是半纖維素的重要組成成分，具有控制血糖、預防便秘、促進雙歧桿菌生長、促進鈣的吸收以及改變骨骼肌纖維成分等生理功能[5-6]。此外，L-阿拉伯糖也是一種重要的醫(yī)藥中間體，用來合成抗癌、抗病毒和治療心腦血管疾病的藥物，還可以作為生化試劑用于細菌培養(yǎng)基的制備，或進行香料的合成，廣泛應用于食品、保健品和醫(yī)藥領域，是備受關注的新型功能糖[7]。纖維素乙醇是先進生物燃料（advanced biofuels）的典型代表，亦是最有前景的石化燃料替代品之一[8]，與以淀粉質原料為主生產的第一代燃料乙醇相比具有諸多優(yōu)勢，是燃料乙醇規(guī)模化、可持續(xù)發(fā)展的方向。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）對葡萄糖和木糖的高效同步共發(fā)酵可提高發(fā)酵液中乙醇濃度和生產速率，普遍被認為是降低纖維素乙醇生產成本的有效措施。另外，除了原料預處理、纖維素酶等占據主要生產成本外，木質纖維素原料本身的成本也日益凸顯。若尋找一種能提供部分碳源同時提供豐富氮源的原料添加至木質纖維素酶解液中進行補料分批發(fā)酵，則可降低原料及氮源成本從而進一步降低纖維素乙醇生產成本，對其規(guī)?；a具有積極意義。大豆渣在提取L-阿拉伯糖之后，尚存在豐富的纖維素、蛋白質等成分，利用纖維素酶及蛋白酶對其進行水解后，理論上可為釀酒酵母發(fā)酵提供豐富的氮源以及碳源補充，從而提高纖維素乙醇的產量和生產效率。

本研究從大豆渣成分分析入手，確定了大豆渣中L-阿拉伯糖、葡萄糖及蛋白質等含量；進一步以硫酸濃度、料液比和水解溫度等為考察指標，通過單因素試驗探索合適的酸水解工藝，優(yōu)化大豆渣原料提取L-阿拉伯糖的條件；利用課題組前期構建的葡萄糖木糖共發(fā)酵釀酒酵母菌株LF1對稀酸預處理玉米秸稈酶解液（enzymatichydrolysateofcorn stover，EHCS）進行分批及補料分批發(fā)酵，通過在發(fā)酵過程中補加酸解大豆渣（acidolysis soybean dregs，ASD）及酶解大豆渣（enzymolysis soybean dregs，ESD），驗證大豆渣中豐富碳源、蛋白及微量元素對提高纖維素乙醇產量、降低發(fā)酵培養(yǎng)基成本的可行性，初步建立大豆渣輔助玉米秸稈酶解液發(fā)酵產乙醇的工藝路線。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株及樣品

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）LF1：課題組前期通過代謝工程及進化工程策略構建選育得到[9]；大豆渣（干基含水量為10.21%）：由山東大學藥學院婁紅祥教授饋贈；稀酸預處理玉米秸稈酶解液（EHCS）：由華東理工大學鮑杰教授饋贈[10]。

1.1.2 化學試劑

酵母膏、蛋白胨（均為生化試劑）：英國OXOID公司；中溫α-淀粉酶（5 000 U/mL）、糖化酶（10萬U/mL）、纖維素酶（20萬U/mL）、酸性蛋白酶（10萬U/g）：山東隆大生物工程有限公司；甲基異丁基甲酮（methyl isobutyl ketone，MIBK）（純度＞99.5%）：美國Sigma公司；葡萄糖（純度＞99.8%）、木糖（純度＞98.0%）、木糖醇（純度＞99.5%）、甘油（純度＞99.0%）、乙酸（純度＞99.5%）、乙醇（純度＞99.7%）、半乳糖（純度＞99.0%）、L-阿拉伯糖（純度＞98.0%）、甘露糖（純度＞98.0%）、纖維二糖（純度＞98.0%）：上海生工生物工程股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：酵母浸出粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，115℃滅菌30 min。固體YEPD培養(yǎng)基滅菌前添加瓊脂粉至20 g/L。

EHCS-YP培養(yǎng)基：添加KH2PO4、（NH4）2SO4、MgSO4至EHCS中，至終質量濃度分別為2 g/L、2 g/L和1 g/L；同時添加酵母浸出粉至10 g/L，蛋白胨至20 g/L；pH值調節(jié)至4.8，115℃滅菌20 min。

EHCS-Urea培養(yǎng)基：添加KH2PO4、（NH4）2SO4、MgSO4至ESCS中，至終質量濃度分別為2 g/L、2 g/L和1 g/L；同時添加尿素（urea）至終質量濃度5 g/L，以部分代替酵母膏和蛋白胨提供發(fā)酵氮源；pH值調至4.8，115℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

LC-20A高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：日本島津公司；Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)：美國Millipore公司；ZWYR-D2403多功能智能三疊加搖床：上海智誠分析儀器制造有限公司；KH-300SPV超聲波清洗機：昆山禾創(chuàng)超聲以期有限公司；BSA124S-CW分析天平、PB-10酸度計：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；DK-8B恒溫水浴槽、DHG-9140A鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；D30核酸蛋白測定儀：艾本德中國有限公司；Fresco17臺式高速離心機：賽默飛世爾科技中國有限公司；L-8900全自動氨基酸分析儀：日本日立公司；HG63鹵素水分測定儀：瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 分析檢測

（1）大豆渣含水量及灰分測定

取粒度較均勻的大豆渣3份，每份質量約0.8～1.0 g，采用鹵素水分測定儀依次測定樣品的含水量，取其平均值得到大豆渣的含水量[11]；灰分測定參照國標GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》[12]。

（2）大豆渣粗脂肪及木質素含量檢測

粗脂肪的測定參照國標GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》中的索氏抽提法[13-15]；木質素含量的測定參照HYMAN D等[16-17]方法。

（3）大豆渣總蛋白及氨基酸組成分析

采用凱氏定氮法[18-19]及全自動氨基酸分析儀[20-21]分別測定大豆渣中總蛋白及氨基酸含量。

（4）大豆渣總糖及淀粉含量測定

參照美國國家可再生能源實驗室（national renewable energylaboratory，NREL）方法采用高效液相色譜測定大豆渣強酸水解液中葡萄糖、木糖、半乳糖、L-阿拉伯糖及甘露糖等的含量，并計算得到大豆渣總糖（包括淀粉、纖維素、半纖維素及可溶性大豆多糖）含量[17]；參照國標GB 5009.9—2016《食品中淀粉的測定》[22]進行大豆渣淀粉含量的測定。色譜條件為：Bio-RadAminexHPX-87P離子交換柱（300mm×7.8 mm），流動相為超純水，流速為0.6 mL/min，柱溫78℃，進樣量為10 μL，采用RID-20A示差折光檢測器（refractive index detector，RID）進行檢測[9，23]。

（5）EHCS糖分分析

EHCS經固液分離，固相和液相組分分別經強酸徹底水解后，經高效液相色譜檢測葡萄糖、木糖、半乳糖、L-阿拉伯糖及甘露糖等含量。

1.3.2 L-阿拉伯糖提取條件優(yōu)化

將大豆渣分別與0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L、0.7mol/L和1.0 mol/L的稀硫酸溶液，按照料液比1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶50（g∶mL）混勻，在80 ℃、90 ℃、100 ℃、110 ℃、120 ℃條件下處理45 min，以水解液中L-阿拉伯糖含量為評價指標，探索L-阿拉伯糖提取的最佳條件。

1.3.3 ASD及ESD制備

在最優(yōu)L-阿拉伯糖酸提取條件下處理大豆渣，之后進行固相和液相分離。固相組分經水洗至中性后自然風干，得到酸解大豆渣ASD；固相組分pH值調節(jié)至酸性蛋白酶最適范圍2.5～3.5，按照0.22g/100g比例添加酸性蛋白酶，50r/min、40℃條件下反應24 h，隨后將全部酶解產物自然風干后，得到酶解大豆渣ESD。

1.3.4 酵母菌種制備及補料分批發(fā)酵

菌種制備：挑取YEPD固體平板上LF1菌落至2mLYEPD液體培養(yǎng)基中活化24 h后，以10%接種量轉接至含有5%（V/V）EHCS的YEPD液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)12 h，離心收集菌體作為發(fā)酵菌種。

發(fā)酵條件：以EHCS-YP為主培養(yǎng)基進行分批發(fā)酵及在發(fā)酵過程中補加ASD進行補料分批發(fā)酵作為對照組；以EHCS-Urea為主培養(yǎng)基，在發(fā)酵過程中補加ESD為實驗組進行補料分批發(fā)酵。發(fā)酵在100 mL限氧搖瓶中進行，發(fā)酵溫度30℃，轉速200 r/min，發(fā)酵底物EHCS的pH值調節(jié)至4.8，初始接種量為0.5 g/L細胞干質量[9]，在發(fā)酵6 h、12 h、24 h和36 h分別補加1.8 g ASD或1.8 g ESD（絕干質量），同時按100 μL/g添加纖維素酶，定期取樣進行底物及代謝產物分析。

1.3.5 發(fā)酵底物及代謝產物分析

發(fā)酵樣品經離心（10 000 r/min、10 min）去除沉淀，用0.22μm微孔濾膜過濾，高效液相色譜法檢測樣品中底物和代謝產物濃度，包括葡萄糖、木糖、木糖醇、甘油、乙酸、乙醇等。色譜條件：Bio-Rad Aminex HPX-87H離子交換柱（300 mm×7.8 mm），流動相為5 mmol/L稀H2SO4，流速0.6 mL/min，柱溫45℃，進樣量為10 μL，RID-20A型示差折光檢測器。

2 結果與分析

2.1 大豆渣成分分析及玉米秸稈水解液糖分分析

大豆渣含水量為10.21%，其灰分、粗脂肪、木質素、蛋白質、總糖等成分檢測結果見表1，氨基酸種類及含量測定結果見表2，大豆渣總糖及淀粉含量檢測結果見表3。稀酸預處理玉米秸稈酶解液（EHCS）的糖分分析見表4。

表1 大豆渣成分分析Table1 Component analysis of soybean dreg

由表1可知，基于大豆渣干質量計算得出，灰分、粗脂肪、蛋白質、木質素及總糖含量分別為6.76%、3.43%、24.11%、8.20%和54.71%。

表2 大豆渣氨基酸含量Table2 Amino acid content in soybean dreg

由表2可知，除天冬酰胺、谷氨酰胺外，共檢測了大豆渣中18種游離氨基酸，其中8種人體必需氨基酸的含量（基于大豆渣干質量計算）分別為蘇氨酸0.96%、纈氨酸1.21%、甲硫氨酸0.25%、異亮氨酸1.05%、亮氨酸1.86%、苯丙氨酸1.27%、賴氨酸1.69%、色氨酸未檢測出。

表3 大豆渣糖類及淀粉含量Table3 Saccharide and starch contents in soybean dreg

由表3可知，大豆渣中葡萄糖、木糖、半乳糖、L-阿拉伯糖及甘露糖等單糖殘基含量（基于大豆渣干質量計算）分別為16.38%、4.71%、18.82%、10.48%和4.32%。淀粉約占大豆渣干質量的3.23%。結果表明，大豆渣中L-阿拉伯糖含量豐富，以其為原料提取L-阿拉伯糖是可行的。

表4 EHCS固相及液相糖分析Table4 Sugar analysis of solid and liquid phase of EHCS

由表4可知，EHCS上清液經強酸徹底水解后，葡萄糖和木糖質量濃度都有顯著提高，其中葡萄糖提高了約17%，由131.9g/L提高至154.0g/L，木糖由12.61g/L提高至25.35g/L，提高了約101%，說明在EHCS液相部分中尚存在一定量的低聚葡萄糖和低聚木糖等組分；此外，EHCS固形物含有約9%的葡萄糖組分，若在發(fā)酵體系中經完全酶解，理論上可提供約19.8 g/L葡萄糖，可為后續(xù)發(fā)酵提供充足碳源。

2.2 大豆渣提取L-阿拉伯糖條件優(yōu)化

稀酸法是木質纖維素預處理過程比較常用且成熟的方法之一[24]，采用稀硫酸對大豆渣進行預處理，初步探索了不同稀硫酸濃度、料液比及處理溫度對L-阿拉伯糖提取效率的影響。

2.2.1 稀硫酸濃度對L-阿拉伯糖提取的影響

將大豆渣分別與0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L、0.7mol/L和1.0 mol/L的稀硫酸溶液配制成料液比為1∶50（g∶mL）的酸水解體系，在120℃條件下對大豆渣處理45 min，以水解液中L-阿拉伯糖含量為評價指標，初步探索不同濃度稀硫酸對大豆渣中L-阿拉伯糖提取的影響，結果如圖1所示。

圖1 不同濃度稀硫酸對L-阿拉伯糖提取的影響Fig.1 Effect of different dilute sulfuric acid concentration on L-arabinose extraction

如圖1所示，在120℃條件下，隨稀硫酸濃度的增加，L-阿拉伯糖濃度及得率隨之呈現先增加隨后降低的趨勢。在0.3～0.5 mol/L稀硫酸濃度下，L-阿拉伯糖質量濃度及得率隨著稀硫酸濃度的增大而增大；并在稀硫酸濃度為0.5 mol/L時，水解液L-阿拉伯糖質量濃度及得率達到最大值；然而，繼續(xù)增加硫酸濃度之后，L-阿拉伯糖質量濃度及得率隨之下降。L-阿拉伯糖濃度降低與其在較高的硫酸濃度下被進一步降解為醛類化合物有關。因此，選擇稀硫酸濃度0.5 mol/L為宜。

2.2.2 料液比對L-阿拉伯糖提取的影響

采用0.5 mol/L的稀硫酸在120℃條件下對大豆渣進行預處理，進一步探索不同料液比條件（1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶50（g∶mL））對L-阿拉伯糖提取的影響，結果如圖2所示。

圖2 不同料液比對L-阿拉伯糖提取的影響Fig.2 Effect of different solid-liquid ratio on L-arabinose extraction

如圖2所示，料液比在1∶50～1∶5（g∶mL）時，隨著底物中大豆渣質量濃度逐漸增加，水解液中L-阿拉伯糖含量也隨之逐漸增加；L-阿拉伯糖得率在料液比為1∶10（g∶mL）時達到最大值0.119g/g大豆渣。而繼續(xù)增加料液比至1∶5（g∶mL），酸水解液中L-阿拉伯糖質量濃度達到最大值21.008 g/L，得率略微下降至0.117 g/g大豆渣?？紤]L-阿拉伯糖濃度高有利于簡化下游純化工藝，同時高的料液比可以大大節(jié)約硫酸成本、用水成本及提高了設備使用效率。因此，選擇料液比1∶5（g∶mL）為宜。

2.2.3 水解溫度對L-阿拉伯糖提取的影響

在料液比1∶5（g∶mL），酸度為0.5 mol/L，水解時間為45 min條件下，選擇120℃、110℃、100℃、90℃、80℃條件對大豆渣進行酸水解預處理，結果如圖3所示。

圖3 不同水解溫度對L-阿拉伯糖提取的影響。Fig.3 Effect of different hydrolysis temperature on L-arabinose extraction

如圖3示，水解溫度由120℃降至100℃，L-阿拉伯糖含量及得率緩慢下降，而水解溫度從100℃逐漸降至80℃時，L-阿拉伯糖質量濃度及得率出現快速下降。綜合L-阿拉伯糖得率及水解工藝復雜性和能耗。因此，水解溫度100℃為宜。

2.3 補料分批發(fā)酵

為探尋在發(fā)酵過程中補加大豆渣能否為纖維素乙醇生產提供氮源及額外的碳源，從而提高纖維素乙醇產量。以EHCS-YP為主培養(yǎng)基進行分批發(fā)酵及在發(fā)酵過程中補加ASD進行補料分批發(fā)酵作為對照組；以EHCS-Urea為主培養(yǎng)基，在發(fā)酵過程中補加ESD為實驗組進行補料分批發(fā)酵，結果見圖4。EHCS分批和補料分批發(fā)酵乙醇產量結果見表5。

圖4 EHCS補料分批發(fā)酵對葡萄糖、木糖及乙醇產量的影響Fig.4 Effect of fed-batch fermentation of EHCS on glucose,xylose and ethanol production

表5 EHCS分批和補料分批發(fā)酵中乙醇得率Table5 Ethanol yields in ESCS by batch and fed-batch fermentation

如圖4A所示，釀酒酵母LF1接種至EHCS-YP培養(yǎng)基，補加ASD及纖維素酶，發(fā)酵64 h時產生約114 g/L乙醇，基于總糖及消耗糖的乙醇得率分別為0.406 g/g和0.493 g/g。

如圖4B所示，釀酒酵母LF1接種至EHCS-Urea培養(yǎng)基，補加ESD及纖維素酶，至發(fā)酵64h產生約110 g/L乙醇，基于總糖及消耗糖的乙醇得率分別為0.402 g/g和0.503 g/g。

由表5可知，無論補加ASD或ESD，發(fā)酵結束乙醇產量與EHCS-YP培養(yǎng)基分批發(fā)酵相比，都有明顯提高，乙醇產量分別增加了約34g/L和30g/L，說明補料ASD或ESD給EHCS為底物的纖維素乙醇發(fā)酵提供了額外的碳源，從而顯著增加了乙醇的產量。

在EHCS-Urea培養(yǎng)基中進行補料分批發(fā)酵，乙醇產量、得率均達到以豐富氮源（酵母膏、蛋白胨）為基礎的發(fā)酵水平，說明ESD中豐富的氨基酸為發(fā)酵過程提供了充足的氮源，尿素和ESD補料相結合可以替代成本較高的酵母膏和蛋白胨，降低纖維素乙醇工業(yè)化生產成本。

補料分批發(fā)酵過程中，木糖消耗速率明顯低于葡萄糖消耗速率，且木糖濃度在24 h后均出現升高的趨勢，分別由約6.7 g/L增加至18.1 g/L（見圖4A）和20.2 g/L（見圖4B）；同時，補料ASD或ESD后，酶解產生的葡萄糖未能被及時消耗，發(fā)酵液中葡萄糖也出現一定程度的積累，如圖4A所示，葡萄糖由3.5 g/L增加至發(fā)酵結束的28.4 g/L。結果表明，由于葡萄糖的存在降低了釀酒酵母菌株LF1對木糖的利用，尤其在EHCS中抑制物存在下，這種抑制作用更加明顯[25]；此外，葡萄糖對木糖利用的后繼效應[26]以及酵母菌株自身活性的降低也導致了發(fā)酵后期葡萄糖和木糖的積累。上述問題的存在降低了纖維素乙醇的產量和生產效率，后期需要通過代謝工程結合進化工程及發(fā)酵過程控制等手段進一步提高釀酒酵母菌株對抑制物的耐受性以及在抑制物存在條件下葡萄糖和木糖的共代謝能力。

3 結論

本研究大豆渣中葡萄糖、半乳糖、L-阿拉伯糖和蛋白質含量分別為16.4%、18.8%、10.5%、24.1%。從大豆渣成分分析入手，進行L-阿拉伯糖提取條件優(yōu)化的單因素試驗，且綜合考慮能耗、硫酸及水用料成本、以及設備利用率，選擇大豆渣與0.5 mol/L稀硫酸按照料液比1∶5（g∶mL）混勻并在100℃條件下水解45 min為大豆渣提取L-阿拉伯糖的最佳條件，在此條件下，L-阿拉伯糖質量濃度為21.0g/L。EHCS發(fā)酵補料ASD或ESD，乙醇產量均可達到110g/L以上，比分批發(fā)酵乙醇產量提高了37%，說明無論酸解大豆渣ASD或是其經蛋白酶酶解后的ESD都可以為纖維素乙醇的發(fā)酵提供額外的碳源，且ESD提供的氮源等營養(yǎng)物能夠與酵母膏蛋白胨相媲美，在一定程度實現對酵母膏和蛋白胨的替代，有效節(jié)約發(fā)酵成本，對纖維素乙醇的經濟有效生產具有重要意義。