玉米素滅菌方式和濃度對藍(lán)莓試管苗增殖的影響

柴慈江，王坤英，張文文，劉春鵬，魏維，鄒航

（1.天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津300384；2.天津市澤芃農(nóng)業(yè)科技有限公司薊州區(qū)澤芃莊園藍(lán)莓種植基地，天津 301900）

藍(lán)莓（blueberry）又名越桔、藍(lán)漿果，為杜鵑花科（Ericaceae）越桔屬（Vaccinium）植物，多年生落葉或常綠灌木。藍(lán)莓果實除含有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等營養(yǎng)物質(zhì)外，還富含VE、VC和VA等維生素和果膠，特別是含有豐富的花青素、黃酮類及多酚類物質(zhì)，這些物質(zhì)具有很強(qiáng)的抗氧化能力，可以改善人體內(nèi)部抗氧化環(huán)境，提高機(jī)體免疫能力。其中花青素在預(yù)防神經(jīng)元和心血管類疾病、糖尿病以及治療癌癥等方面起著重要作用，因此，藍(lán)莓具有良好的營養(yǎng)保健作用，可防止腦神經(jīng)老化、強(qiáng)心、抗癌、軟化血管、增強(qiáng)人的機(jī)體免疫能力、保護(hù)視力、提高記憶力水平、改善睡眠、強(qiáng)身健體等，被國際糧農(nóng)組織認(rèn)定為五大健康食品之一[1-3]。

我國藍(lán)莓栽培起步較晚，但近年來發(fā)展很快，2008—2014年，藍(lán)莓產(chǎn)量以平均每年50.7%的速度遞增，2017年栽培面積達(dá)到31 210 hm2，總產(chǎn)量為114 905 t，預(yù)計到2026年，我國將超越北美成為全球第一藍(lán)莓生產(chǎn)國[4]。我國藍(lán)莓栽培的快速發(fā)展帶來藍(lán)莓苗木的大量需求，而組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)是滿足藍(lán)莓苗木需求的有效途徑。目前，我國藍(lán)莓組培快繁技術(shù)比較成熟，有的單位已經(jīng)具備了年產(chǎn)100萬苗木的生產(chǎn)能力[5]。

試管苗的增殖培養(yǎng)是藍(lán)莓組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，玉米素（簡稱ZT）則是藍(lán)莓試管苗增殖培養(yǎng)中使用最為普遍的植物激素。關(guān)于玉米素的滅菌方式，一些教科書中認(rèn)為玉米素在高溫下易于分解，應(yīng)該采用過濾滅菌方式滅菌[6-7]，有的研究也明確提出玉米素采用了過濾滅菌的方式[8]。但有的研究中對玉米素的滅菌則采用了高溫滅菌方式[9-10]，而大多數(shù)研究沒有明確述及玉米素的滅菌方式。過濾滅菌方式由于操作程序比較復(fù)雜，會給試管苗大規(guī)模繁殖中培養(yǎng)基的配制工作帶來不便。而高溫滅菌會對玉米素的作用產(chǎn)生多大影響，對此尚未見研究報道。此外，目前研究中關(guān)于玉米素的使用濃度也不盡一致。本文對玉米素的滅菌方式及使用濃度進(jìn)行了探討，以便為完善藍(lán)莓組培快繁技術(shù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

以在含有ZT 1.0 mg/L的WPM培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)的藍(lán)莓試管苗為試材，進(jìn)行下列2項試驗。

1.1 ZT的滅菌方式對藍(lán)莓試管苗莖芽增殖影響的研究

以WPM培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中分別添加濃度為1.0 mg/L和2.0 mg/L的ZT，ZT的滅菌方式分為常規(guī)高溫滅菌和過濾滅菌兩種方式。

高溫滅菌：將ZT加入培養(yǎng)基后與培養(yǎng)基在滅菌鍋中121 ℃保持16 min。

過濾滅菌：先將未添加ZT的培養(yǎng)基在滅菌鍋中以121 ℃保持16 min進(jìn)行高溫滅菌，待培養(yǎng)基冷卻至40～50 ℃時，在超凈工作臺的無菌環(huán)境中將玉米素用過濾器過濾除菌，然后加入到培養(yǎng)基中。

試驗共設(shè)5個處理：ZT 1.0 mg/L＋高溫滅菌，ZT 2.0 mg/L＋高溫滅菌，ZT 1.0 mg/L＋過濾滅菌，ZT 2.0 mg/L＋過濾滅菌，ZT 0 mg/L＋高溫滅菌。各培養(yǎng)基的pH值均調(diào)至5.3，用8.0 g/L的瓊脂做固化劑。各個處理的培養(yǎng)基滅菌后，將‘公爵’‘北陸’‘愛國者’3個品種的藍(lán)莓試管苗莖段分別接種于各種培養(yǎng)基中，接種莖段長度為1.5～2.0 cm，每個品種每種處理接種3瓶，每瓶4個莖段，共12個莖段。

上述各處理接種后，放在培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度1 500～2 000 Lx，溫度23～28 ℃，光照時間14 h/d。培養(yǎng)40 d后，調(diào)查萌芽率、莖尖數(shù)、最大莖長及繁殖系數(shù)等各項指標(biāo)，其中莖尖數(shù)為一個培養(yǎng)周期后的莖尖總數(shù)，最大莖長為接種莖段新形成的分枝中最長分枝的長度，繁殖系數(shù)為接種莖段在一個培養(yǎng)周期后形成的可用于再接種的莖段數(shù)。用卡平方法對萌芽率做獨(dú)立性測驗，其他各項指標(biāo)按照完全隨機(jī)試驗單向分組資料的方法做方差分析，并用鄧肯氏新復(fù)極差法做多重比較。

1.2 ZT濃度對藍(lán)莓試管苗莖芽增殖影響的研究

以WPM培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中分別加入濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/L的ZT，并加入蔗糖20 g/L，瓊脂8 g/L，pH調(diào)節(jié)至5.3，培養(yǎng)基分裝封口后，在滅菌鍋中進(jìn)行高溫滅菌（121 ℃，16 min）。培養(yǎng)基滅菌后，將‘藍(lán)豐’‘北陸’和‘愛國者’3個品種的藍(lán)莓試管苗莖段分別接種于各種培養(yǎng)基中，接種莖段長度1.5～2.0 cm，每個品種每種處理接種2瓶，每瓶5個莖段共10個莖段。

上述各處理接種后，放在培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同試驗1.1。培養(yǎng)40 d后，調(diào)查莖尖數(shù)、最大莖長及繁殖系數(shù)等各項指標(biāo)，各項指標(biāo)的統(tǒng)計分析方法同試驗1.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZT滅菌方式對藍(lán)莓試管苗莖芽增殖的影響

ZT不同滅菌方式各處理培養(yǎng)的藍(lán)莓試管苗萌芽及莖芽增殖情況見表1、表2。

由表1可見，對于‘公爵’和‘愛國者’品種，所有添加ZT的處理的莖段中下部芽萌芽率、莖段頂部芽萌芽率及總萌芽率均顯著高于未添加ZT的處理，而且ZT的高溫滅菌和過濾滅菌處理之間無顯著差異。對于‘北陸’藍(lán)莓品種，各處理之間莖段頂部芽的萌芽率無顯著差異，但是添加ZT處理的莖段中下部芽的萌芽率顯著高于未添加ZT處理，除高溫滅菌的ZT 1.0 mg/L處理外，其余各ZT處理的總萌芽率顯著高于未添加ZT處理。ZT濃度為2.0 mg/L時，高溫滅菌與過濾滅菌2個處理之間的莖段萌芽率無顯著差異，ZT濃度為1.0 mg/L時，過濾滅菌的莖段萌芽率顯著高于高溫滅菌。

上述結(jié)果表明，對于‘公爵’和‘愛國者’2個藍(lán)莓品種，ZT濃度為1.0 mg/L和2.0 mg/L時均可明顯促進(jìn)莖段萌芽率的提高，ZT的高溫滅菌和過濾滅菌對萌芽率的促進(jìn)效果無明顯差異。對于‘北陸’藍(lán)莓，ZT濃度為2.0 mg/L時，ZT的高溫滅菌和過濾滅菌對萌芽率的促進(jìn)效果無明顯差異。

表1 ZT不同滅菌方式處理下藍(lán)莓試管苗的萌芽狀況

由表2可見，對于‘公爵’，過濾滅菌的ZT 1.0 mg/L處理的莖尖數(shù)與未添加ZT處理無顯著差異，但顯著低于高溫滅菌的ZT 1.0 mg/L處理及其他添加ZT各處理；在最大莖長和繁殖系數(shù)上，添加ZT的各處理均顯著高于未添加ZT處理，ZT的高溫滅菌和過濾滅菌處理之間則差異不顯著。

對于‘北陸’，高溫滅菌的ZT 1.0 mg/L處理的莖尖數(shù)顯著低于過濾滅菌處理，但是其最大莖長則顯著高于過濾滅菌的ZT 2.0 mg/L處理并與過濾滅菌的ZT 1.0 mg/L無顯著差異。在繁殖系數(shù)上所有添加ZT的處理均顯著高于未添加ZT的處理，并且ZT的高溫滅菌和過濾滅菌處理之間無顯著差異。

對于‘愛國者’，兩個高溫滅菌的ZT處理的莖尖數(shù)均顯著高于未添加ZT的處理，高溫滅菌的ZT 1.0 mg/L處理的莖尖數(shù)顯著高于過濾滅菌的ZT 1.0 mg/L處理；在最大莖長和繁殖系數(shù)上添加ZT的各處理均顯著高于未添加ZT的處理，兩種滅菌方式之間差異不顯著。

綜合上述，添加ZT可以明顯促進(jìn)藍(lán)莓莖段萌芽，并明顯增加繁殖系數(shù)。在ZT濃度為1.0 mg/L和2.0 mg/L時，對ZT采用高溫滅菌和過濾滅菌對供試3個品種藍(lán)莓試管苗的繁殖系數(shù)的影響無明顯差異，因此，為簡化藍(lán)莓增殖培養(yǎng)基的配制工作，對ZT可以采用高溫滅菌的方法進(jìn)行滅菌。

表2 ZT不同滅菌方式處理下藍(lán)莓試管苗莖芽增殖狀況

供試3個品種藍(lán)莓試管苗在各處理中的生長狀況見圖1。

圖1 不同ZT滅菌方式處理下3個品種藍(lán)莓試管苗生長狀況

2.2 ZT濃度對藍(lán)莓試管苗莖芽增殖的影響

不同ZT濃度試驗的結(jié)果見表3。

表3 ZT濃度對藍(lán)莓試管苗增殖培養(yǎng)的影響

由表3可見，對于‘藍(lán)豐’，ZT濃度在0.5～3.0 mg/L時各處理之間的莖尖數(shù)、最大莖長和繁殖系數(shù)等各項指標(biāo)均無顯著差異。

對于‘北陸’，在ZT濃度0.5～3.0 mg/L范圍內(nèi)，隨著ZT濃度增高，大致呈現(xiàn)出莖尖數(shù)增加而最大莖長下降的趨勢，繁殖系數(shù)的表現(xiàn)不規(guī)律，ZT濃度為0.5 mg/L的處理繁殖系數(shù)最高，并與ZT濃度3.0 mg/L的處理無顯著差異，但顯著高于ZT濃度1.0～2.0 mg/L的3個處理。

對于‘愛國者’，ZT濃度為0.5 mg/L處理的莖尖數(shù)顯著低于其他各處理，但其最大莖長顯著高于ZT濃度為3.0 mg/L處理并與其他處理無顯著差異，ZT濃度為0.5 mg/L處理的繁殖系數(shù)與ZT 1.0、1.5 mg/L兩個處理差異不顯著，但顯著高于ZT 2.0、3.0 mg/L兩個處理。

綜上分析，對于供試的3個藍(lán)莓品種，雖然對ZT的反應(yīng)不盡一致，但是當(dāng)ZT濃度為0.5 mg/L時的繁殖系數(shù)均較高，且不低于其他各處理，繁殖系數(shù)分別達(dá)到6.3（‘藍(lán)豐’）、5.9（‘北陸’）和5.2（‘愛國者’），從降低成本和增殖培養(yǎng)效果兩方面考慮，ZT濃度為0.5 mg/L處理為這3個藍(lán)莓品種試管苗增殖培養(yǎng)的最佳處理。

不同ZT濃度處理的藍(lán)莓試管苗增殖培養(yǎng)狀況見圖2。

圖2 不同ZT濃度處理藍(lán)莓試管苗增殖培養(yǎng)狀況

3 討論與小結(jié)

玉米素是從甜玉米灌漿期的籽粒中提取并結(jié)晶出的第一個天然細(xì)胞分裂素，并且能夠人工合成。在藍(lán)莓試管苗增殖培養(yǎng)中，玉米素是使用最為普遍的細(xì)胞分裂素。通常認(rèn)為，玉米素在高溫下容易分解，因此在配制培養(yǎng)基時對玉米素應(yīng)該采取過濾滅菌方式滅菌[6-7]。陳鎮(zhèn)在其藍(lán)莓組織培養(yǎng)的研究中，在培養(yǎng)基配制時對玉米素就采用了過濾滅菌，并且當(dāng)ZT濃度為1.0 mg/L時，布里吉塔藍(lán)莓品種的繁殖效率最高達(dá)到5.3[8]。過濾滅菌操作比較繁瑣，會對藍(lán)莓試管苗大規(guī)模繁殖中培養(yǎng)基配制工作帶來不便，影響工作效率。金如意等研究采用了將玉米素與培養(yǎng)基同時高溫滅菌的方法，結(jié)果表明當(dāng)ZT濃度為1.0 mg/L時，藍(lán)莓叢生芽的數(shù)量增加1.82倍，所形成的嫩莖平均高達(dá)44.7 mm，獲得了較高的增殖效率[9]。尹利方等在對康維爾藍(lán)莓品種的研究中，也對玉米素連同培養(yǎng)基進(jìn)行高溫滅菌，當(dāng)ZT濃度為1.0 mg/L時試管苗的增殖系數(shù)達(dá)到12.47[10]。這兩項研究結(jié)果表明，對玉米素進(jìn)行高溫滅菌是可行的。李俊明等在其編譯的《植物組織培養(yǎng)教程》中也認(rèn)為各種細(xì)胞分裂素都具有熱穩(wěn)定性[11]。本項結(jié)果中，當(dāng)玉米素濃度為1.0 mg/L和2.0 mg/L時，無論對玉米素采用過濾滅菌還是高溫滅菌，均可以明顯促進(jìn)供試藍(lán)莓品種試管苗莖段的萌芽和增加繁殖系數(shù)，且這兩種滅菌方式之間無顯著差異，表明高溫滅菌對玉米素的作用沒有明顯的不利影響，這一結(jié)果與金如意和尹利方等的研究結(jié)果基本一致。

在藍(lán)莓試管苗增殖培養(yǎng)中，對于ZT的使用濃度的研究報道不盡一致。廉家盛等研究認(rèn)為，‘美登’藍(lán)莓在含有ZT 2.0 mg/L的B5培養(yǎng)基中繁殖系數(shù)最高[12]。楊艷敏等研究結(jié)果表明，‘斯巴坦’藍(lán)莓在ZT濃度為0.7 mg/L時增殖效果最好，‘伯克利’藍(lán)莓在ZT濃度為0.5 mg/L時增殖效果最好，而‘北陸’藍(lán)莓在ZT濃度為0.5 mg/L時增殖倍數(shù)最高，但苗較細(xì)弱[13]。李麗容等研究認(rèn)為，在含有ZT 2～3 mg/L的 WPM培養(yǎng)基上藍(lán)莓試管苗的增殖培養(yǎng)效果較好，繁殖系數(shù)大且生長健壯[14]。龔雪元等研究認(rèn)為，南高叢藍(lán)莓最佳增殖培養(yǎng)基為WPM＋ZT 2.0 mg/L[15]。陶興魁等研究認(rèn)為，在含有ZT 1.0 mg/L＋6-BA 1.0 mg/L的改良WPM培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的藍(lán)莓叢生芽最多[16]。張舵等研究認(rèn)為，‘斯巴坦’藍(lán)莓試管苗增殖培養(yǎng)基最佳激素配比為ZT 0.3 mg/L＋I(xiàn)BA 0.2 mg/L，“北陸”藍(lán)莓最佳激素配比為ZT 0.3 mg/L＋I(xiàn)BA 0.1 mg/L[17]。沙玉芬等研究認(rèn)為，‘杜克’藍(lán)莓試管苗最佳增殖培養(yǎng)基的ZT濃度為1.0 mg/L[18]。黃科等研究認(rèn)為‘夏普藍(lán)’藍(lán)莓最佳增殖培養(yǎng)基CQWL＋ZT 1.5 mg/L[19]。韓陽花研究表明，野生藍(lán)莓試管苗最佳的增殖培養(yǎng)基為含有ZT 1.0 mg/L的WPM培養(yǎng)基[20]。陳鎮(zhèn)研究認(rèn)為，‘布里吉塔’藍(lán)莓在WPM＋ZT 0.5 mg/L培養(yǎng)基中、‘夏普藍(lán)’藍(lán)莓在AN＋ZT 0.5 mg/L培養(yǎng)基中均可以有效的繼代擴(kuò)增培養(yǎng)[8]。從目前的研究文獻(xiàn)看，在單純使用ZT的培養(yǎng)基中，ZT濃度的使用范圍大致在0.5～3.0 mg/L之間，變化較大。之所以產(chǎn)生這樣大的變化，可能與研究者使用的藍(lán)莓品種、基本培養(yǎng)基以及試材的生理狀態(tài)不同有關(guān)。陳鎮(zhèn)[8]和肖海峻等[21]的研究都表明，藍(lán)莓的不同品種之間在相同ZT濃度下的增殖效果存在明顯差異。因此，針對藍(lán)莓的不同品種研究其適宜的ZT濃度是必要的。本項研究中，‘藍(lán)豐’‘北陸’和‘愛國者’3個藍(lán)莓品種試管苗在含有ZT 0.5 mg/L的WPM培養(yǎng)基上的繁殖系數(shù)均表現(xiàn)較高，這一結(jié)果與陳鎮(zhèn)[8]和楊艷敏等[13]的研究基本一致。

綜上認(rèn)為，在藍(lán)莓試管苗增殖培養(yǎng)中，玉米素的高溫滅菌（121 ℃下保持16 min）對藍(lán)莓試管苗增殖效果不會產(chǎn)生明顯的不利影響?！{(lán)豐’‘北陸’和‘愛國者’3個品種藍(lán)莓試管苗增殖培養(yǎng)中，以采用WPM＋ZT 0.5 mg/L的培養(yǎng)基為宜，培養(yǎng)效果較好，且成本較低。