養(yǎng)分添加對(duì)白樺葉片氣孔和氣體交換異質(zhì)性影響研究

劉力銘，孫志虎，李開隆，龔麗芳

（東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

氣孔作為植物氣體交換的主要通道，其特征由遺傳因素與非遺傳因素共同影響，多數(shù)植物氣孔特征對(duì)環(huán)境因素變化較敏感，性狀不穩(wěn)定[1]。近些年來(lái)，因其具有指示大氣CO2與氣候變化的特點(diǎn)，從而使得利用化石氣孔數(shù)據(jù)重建古氣候成為可能[2-3]。氣孔密度（SD）的變化能夠體現(xiàn)植物耐旱性或營(yíng)養(yǎng)攝取能力的調(diào)整[4]。隨著葉片氣孔特征與氣體交換研究的不斷深入，研究發(fā)現(xiàn)同一葉片不同區(qū)域（葉尖、葉中、葉基）氣孔分布與氣體交換具有差異[5-8]，然而這種差異的發(fā)生仍無(wú)定論，普遍認(rèn)為基因決定著氣孔在葉片上的分布，然而外界環(huán)境差異也是植物生長(zhǎng)過(guò)程中不可忽略的重要影響因素。研究結(jié)果表明，養(yǎng)分變化對(duì)葉片光合能力與SD均會(huì)產(chǎn)生顯著影響[9-11]。林木光合特性方面的現(xiàn)有研究多集中于生態(tài)因子（如溫度、CO2濃度、光照等）對(duì)整張葉片光合特征的影響方面[12-14]，缺少同一葉片不同區(qū)域間光合和氣孔特征的差異性研究。氣孔作為氣體交換的主要通道，在不同養(yǎng)分條件下葉片氣體交換特征存有差異的同時(shí)葉片氣孔分布特征（如SD）是否也發(fā)生相應(yīng)的變化？同一葉片不同區(qū)域間的二者關(guān)系是否受到土壤養(yǎng)分狀態(tài)的影響等問(wèn)題研究卻少見報(bào)到。

白樺Betula platyplylla是東北森林的重要組成樹種，進(jìn)行不同養(yǎng)分狀態(tài)下白樺葉片氣體交換特征研究對(duì)于揭示天然白樺在葉片水平適應(yīng)環(huán)境變化的策略具有重要意義。本研究利用養(yǎng)分添加后白樺葉片不同區(qū)域氣體交換特征與SD的調(diào)查結(jié)果，分析二者間的關(guān)系，評(píng)價(jià)養(yǎng)分差異和氣孔密度變化對(duì)葉片氣體交換特征的影響，以期為不同生境下白樺的適應(yīng)機(jī)制研究和育林改造等營(yíng)林技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于東北林業(yè)大學(xué)強(qiáng)化育種基地6號(hào)溫棚中進(jìn)行。所選種子采自同一株母樹。4月23日，將事先浸泡催芽處理過(guò)的白樺種子點(diǎn)播于25孔（每孔規(guī)格8 cm×8 cm×8 cm）的蜂巢狀育苗盤（盤中育苗基質(zhì)為草炭、沙子、黑土按照5∶2∶1的比例混合，未施肥前的土壤N、P、K、硝態(tài)N、氨態(tài)N、有效P、速效K含量分別為5.55、0.59、4.54 g/kg和82.36、13.13、10.70、92.95 mg/kg[10]），每孔點(diǎn)播種子3～4粒，共25盤。5月上旬，每孔定植1株白樺。6月23日，幼苗高度為10 cm左右時(shí)，將25盤的白樺幼苗分成25組（每組1盤，每組25株幼苗），按照L25(56)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行定量施肥（表1）。一次性增施N、P、K肥的最大量是按照連續(xù)72 d，每2 d澆灌1次，累計(jì)澆灌4 320 ml Hogland營(yíng)養(yǎng)液的標(biāo)準(zhǔn)換算為化肥量一次性施入土壤，養(yǎng)分添加時(shí)所使用的N、P、K為分析純級(jí)的過(guò)磷酸鈣（P）、硫酸鉀（K）和尿素（N）自行配置。養(yǎng)分增施時(shí)采用撒施方式添加P，采用水溶液的方式噴施N和K于土壤中。

1.2 試驗(yàn)方法

8月7—10日，每種處理均隨機(jī)選擇3株苗高為15 cm以上的幼苗為對(duì)象，選取施肥后新長(zhǎng)成的苗莖的中上部位的完全展開葉，利用 Li-6400 便攜式光合測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定葉片3個(gè)區(qū)域(葉尖、葉中和葉基)的凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、氣孔導(dǎo)度（Gs），測(cè)量時(shí)確保葉片3個(gè)區(qū)域在葉室中沒(méi)有重疊。完后，將相應(yīng)葉片摘下進(jìn)行3個(gè)區(qū)域SD的調(diào)查。SD調(diào)查時(shí)，3個(gè)區(qū)域均選擇3個(gè)視野（共9個(gè)視野點(diǎn)，面積為0.3 mm2）進(jìn)行拍照，所用拍照設(shè)備為基恩士（KEYENCE）超景深三維數(shù)碼顯微系統(tǒng)VHX-5000。利用Image-Pro plus6.0（Media Cybernetics公司）軟件計(jì)量每個(gè)視野中的氣孔數(shù)，并計(jì)算氣孔密度（個(gè)/mm2）。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行描述統(tǒng)計(jì)分析；利用 SPSS19.0（SPSS Inc.，Chicago，IL,USA）進(jìn)行正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析；利用Duncan法進(jìn)行不同施肥水平間的差異比較；并對(duì)氣體交換各項(xiàng)參數(shù)與氣孔密度進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。

表1 L25(56)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（每株苗各類化肥施肥量）?Table1 L25(56) orthogonal experiment design (the amount of different fertilizers for per plant)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥水平對(duì)不同區(qū)域氣體交換與氣孔密度的影響

P、N因素對(duì)白樺葉片葉尖Pn影響均顯著（P＜0.05）。雖然K因素對(duì)白樺葉尖Pn影響不顯著但交互作用對(duì)葉尖Pn影響均極顯著（P＜0.01）。N因素下N2水平的Pn的較高，然后隨著N施入量的減少逐漸降低，說(shuō)明N1的施入量過(guò)高不利于葉尖的光合作用。P因素下P4水平的Pn較高，隨著P施入量的減少葉尖的Pn呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，說(shuō)明少量的P會(huì)增加葉尖的Pn。N、P、K以及交互作用對(duì)白樺葉片葉尖的Tr影響均不顯著。N、P、K各個(gè)因素對(duì)葉尖Gs影響均不顯著，而NP、PK、NPK交互作用對(duì)Gs影響顯著（P＜0.05）。N、P、K以及交互作用對(duì)白樺葉片葉尖SD影響均不顯著。綜上，N、P對(duì)葉尖Pn的影響較大，單一的N、P、K養(yǎng)分變化對(duì)白樺葉片葉尖的Gs影響并不大。而交互施肥導(dǎo)致的養(yǎng)分變化則會(huì)強(qiáng)烈影響葉尖的Gs。N、P、K及其交互作用對(duì)白樺葉片葉尖的Tr與SD影響均不顯著（表2）。

表2 N、K、P及其交互作用對(duì)白樺葉尖氣體交換與氣孔密度的影響?Table2 Effects of N, K, P and their interactions on gas exchange and stomatal density of leaf tip

N、K、P及其交互作用對(duì)白樺葉中氣體交換與氣孔密度的影響見表3。N、P因素對(duì)葉中Pn影響均顯著（P＜0.05），而K因素對(duì)葉中的Pn影響不顯著，但交互作用對(duì)葉中Pn影響均極顯著（P＜0.01），這與其對(duì)葉尖的影響一致，葉中Pn數(shù)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于葉尖，并且葉中的Pn與葉尖Pn的變化較為相似。與葉尖相同各因素對(duì)白樺葉片葉中的Tr影響均不顯著。N、P、K對(duì)葉中Gs影響均不顯著，而交互作用對(duì)葉中Gs影響均顯著（P＜0.05）。雖然NP、NK、PK交互作用對(duì)白樺葉中SD影響均不顯著，但是與葉尖不同的是P不同水平對(duì)SD影響顯著（P＜0.05）,K不同水平對(duì)SD影響極顯著（P＜0.01），并且N、P、K交互作用對(duì)白樺葉中SD影響顯著（P＜0.05）。綜上，施肥對(duì)葉中的SD影響與葉尖較不同，并且氣體交換參數(shù)均小于葉尖，除此之外施肥對(duì)葉中與葉尖的影響大致相同。

表3 N、K、P及其交互作用對(duì)白樺葉中氣體交換與氣孔密度的影響?Table3 Effects of N, K, P and their interactions on gas exchange and stomatal density of leaf middle part

各個(gè)因素水平對(duì)白樺葉基Pn影響與葉尖、葉中相同。但與葉尖和葉中不同是P對(duì)葉基的Tr影響顯著（P＜0.05），其他各因素水平對(duì)白樺葉片葉基的Tr影響均不顯著。N、P、K對(duì)葉基Gs影響均不顯著，而NP、PK交互作用對(duì)Gs影響依然顯著（P＜0.05）。這一結(jié)果與葉尖相同。N、P、K以及NP、NK、PK交互作用對(duì)白樺葉片葉基SD影響均不顯著（P＜0.05），這與葉尖的結(jié)果一致（表4）。

通過(guò)觀察不同處理下葉尖、葉中、葉基的氣體交換與SD發(fā)現(xiàn)不同處理葉中與葉基Pn、Tr、Gs的結(jié)果具有相同趨勢(shì)并且大小相接近，但葉中略高于葉基，雖然葉尖總體趨勢(shì)與葉中、葉基相同，但葉尖的Pn、Tr、Gs明顯大于葉中與葉基的Pn、Tr、Gs。因此白樺葉片氣體交換異質(zhì)性主要存在于葉尖對(duì)葉中和葉基的異質(zhì)性上。而SD在葉片不同區(qū)域分布較均勻，但葉中SD受養(yǎng)分變化要比葉尖、葉中明顯，并且相比Tr、Gs與SD，白樺葉片各個(gè)區(qū)域Pn受養(yǎng)分變化影響較大（表2—4）。

表4 N、K、P及其交互作用對(duì)白樺葉基氣體交換與氣孔密度的影響?Table4 Effects of N, K, P and their interactions on gas exchange and stomatal density of leaf base

2.2 白樺葉片不同區(qū)域凈光合速率與蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度、氣孔密度的相關(guān)關(guān)系

白樺葉片各區(qū)域的Pn和Tr、Gs、SD的相關(guān)性分析見表5。葉中與葉基的Pn和Tr顯著。而葉尖與葉中、葉基不同，葉尖的Pn和Tr相關(guān)性不顯著。因此白樺葉片不同區(qū)域的氣體交換異質(zhì)性也表現(xiàn)在Pn和Tr的異質(zhì)性上。Pn與Gs在葉片各個(gè)區(qū)域均有極其顯著的正相關(guān)。Pn與SD在葉片各個(gè)區(qū)域均沒(méi)有顯著的相關(guān)性。此外不同區(qū)域氣體交換數(shù)值與SD相關(guān)性均不顯著。綜上說(shuō)明白樺葉片不同區(qū)域氣體交換特征存在差異可能是由于氣孔密度以外的因素引起。

表5 白樺葉片不同區(qū)域凈光合速率與蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度、氣孔密度相關(guān)關(guān)系?Table5 Correlation between net photosynthetic rate and transpiration rate, stomatal conductance and stomatal density in different regions of B.platyphylla leaf

3 結(jié)論與討論

N、P、K是植物成長(zhǎng)過(guò)程中最重要的三大元素，適量的施入N、P、K會(huì)有利于葉片光合作用，而過(guò)多的施入不僅不利于葉片光合有機(jī)物積累，相反還會(huì)起到抑制作用。本試驗(yàn)通過(guò)正交試驗(yàn)的優(yōu)勢(shì)來(lái)達(dá)到養(yǎng)分條件的不同變化，從而觀察葉片氣體交換與氣孔密度在葉片水平上的變化。其目的在于更好地了解環(huán)境條件變化的同時(shí)，植物器官對(duì)其反應(yīng)的方式與策略，其結(jié)果可以為后續(xù)的科學(xué)問(wèn)題提供假設(shè)與猜想。本研究表明白樺幼苗葉片光合作用受養(yǎng)分變化影響較大，不論葉尖、葉中、葉基都達(dá)到了極顯著。尤其是N和P對(duì)其的影響要比K明顯。研究表明增施N肥能有效地提高葉片中葉綠素含量以及Rubisco酶含量，從而提高葉片的Pn，而過(guò)量的施入會(huì)導(dǎo)致Rubisco酶含量超出正常值，降低葉片的光合速率[16]。本研究中葉片各個(gè)部位由于N1水平N施入量的過(guò)高導(dǎo)致Pn下降，N2水平的Pn最高，隨后隨著N含量的降低逐漸減小。P作為光合磷酸化的主要原料對(duì)光合作用也同樣具有重要影響。本研究中葉片各個(gè)部位隨著P肥施用量的降低呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢(shì)，并在P4水平下最高。說(shuō)明過(guò)高的P也會(huì)抑制葉片的Pn。此外本研究發(fā)現(xiàn)盡管不同養(yǎng)分條件對(duì)光合作用影響較大，但是對(duì)葉片Tr影響不大，僅發(fā)現(xiàn)P對(duì)葉基Tr有顯著影響。因此說(shuō)明在養(yǎng)分條件改變時(shí)蒸騰作用的強(qiáng)度不一定會(huì)與光合同步。養(yǎng)分條件的改變并不會(huì)像其他因素改變光合作用強(qiáng)度的同時(shí)使得蒸騰也隨之發(fā)生很大的變化，例如溫度、有效光輻射、水分、CO2濃度等。本實(shí)驗(yàn)中蒸騰沒(méi)有像光合那樣受控于養(yǎng)分條件，分析其原因可能與水分限制有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)不同養(yǎng)分條件下Gs也有顯著變化，雖然N、P、K單個(gè)營(yíng)養(yǎng)元素對(duì)其影響不顯著，但交互作用顯著影響白樺葉片氣孔導(dǎo)度。而多數(shù)研究表明Gs與Tr均有很強(qiáng)的相關(guān)性。例如鄭鳳英[17]的研究表明在水分脅迫下Gs與Tr呈正相關(guān)。但王春枝[19]通過(guò)施肥的角度研究表明Gs與Pn是一致的[18]。并有研究表明在未受到水分虧缺的情況下，Gs與Tr呈正相關(guān)，但是從對(duì)Gs的影響大小看，與光合作用的影響一致。因此分析其原因可能由于本實(shí)驗(yàn)中水分不充足，植物保水功能增強(qiáng)，由于其光合作用的改變使得進(jìn)入葉片中的CO2量發(fā)生改變從而間接影響了白樺葉片Gs的顯著變化，而并非由于蒸騰作用導(dǎo)致其改變。這也可以解釋為什么多數(shù)研究中，施肥過(guò)后水分利用效率大幅增強(qiáng)的原因。

對(duì)葉片氣孔分布的報(bào)道已有很多[20-21]。樹木葉片在發(fā)育過(guò)程中，很大一部分原因是基因控制著細(xì)胞分裂與分化導(dǎo)致SD與氣孔分布在葉片上的異質(zhì)性。Poole等將氣孔在葉片上的變化歸結(jié)于3個(gè)原因，一是氣孔和表皮細(xì)胞的不均勻分化，導(dǎo)致響應(yīng)的細(xì)胞數(shù)量變化（分化假說(shuō)），二是表皮細(xì)胞膨脹導(dǎo)致氣孔間距不均勻（膨脹假說(shuō)），三是前二個(gè)原因的混合（混合假說(shuō)）[22]。然而環(huán)境因素也是影響氣孔發(fā)育的一個(gè)重要因素，如，輻射強(qiáng)度、濕度、溫度、大氣CO2和臭氧含量，土壤水分和營(yíng)養(yǎng)的可用性[23]。也有研究表明植物可通過(guò)已經(jīng)形成的器官感受外界環(huán)境后，將環(huán)境信號(hào)反饋給植物本體影響即將形成的組織器官的形態(tài)，進(jìn)而來(lái)適應(yīng)環(huán)境變化[24-25]。而氣孔因素對(duì)光合CO2同化的影響也一直存在爭(zhēng)議，部分研究表明葉片氣體交換與氣孔的因素相關(guān)性很強(qiáng)[26]，也有研究表明氣體交換并非完全受控于氣孔因素[27]。本研究中白樺SD在葉片不同部位沒(méi)有顯著差異，SD與各項(xiàng)氣體交換之間未達(dá)到顯著水平，說(shuō)明白樺葉片氣體交換異質(zhì)性主要由SD以外的因素引起的。這與Nardini等（2008）的研究相似，其在煙草葉片氣體交換的空間異質(zhì)性調(diào)查中發(fā)現(xiàn)葉尖對(duì)水蒸氣的傳導(dǎo)速率比葉基高18%，葉尖導(dǎo)電率也比葉基部分高30%[28]。而葉尖與葉基的SD卻沒(méi)有明顯差異，同樣說(shuō)明葉片各部位功能異質(zhì)性與SD差異并非同步。對(duì)這種葉片光合異質(zhì)性的看法也有不同的解釋，Strain等[5]認(rèn)為葉片從葉基部位開始生長(zhǎng)，葉基部位要比葉尖部位的組織年輕，而較老的組織更能適應(yīng)強(qiáng)光照，Xiong等[6]通過(guò)調(diào)查兩個(gè)品種的水稻氣體交換特性參數(shù)與葉片結(jié)構(gòu)的化學(xué)特性表明氣孔和葉綠素含量從葉基部到葉尖部分逐漸增加。Xiao等[7]的研究表明即使葉綠體位于葉子表面的距離相同，其受光環(huán)境也會(huì)有截然不同，由于葉片不同區(qū)域的葉表皮組織差異，也會(huì)影響葉片光合效率。也有研究表明N對(duì)提高光系統(tǒng)Ⅱ（photosystemⅡ，簡(jiǎn)稱PSⅡ）有顯著作用[29]，鹽脅迫與高溫均會(huì)對(duì)PSⅡ的異質(zhì)性產(chǎn)生影響[30-31]。由此表明葉片光合異質(zhì)性可能受控于多種因素的共同影響。王碧霞等[8]利用網(wǎng)格與二維成圖的方法對(duì)青楊雌雄葉片各區(qū)域氣孔分布及氣體交換特征的研究發(fā)現(xiàn)，不同區(qū)域氣孔分布于氣體交換有明顯的不同，在雌株中葉基的Pn最低，葉尖的Pn最高，并相差3～4倍以上。雖然雌雄同一葉片的Pn都具有異質(zhì)性，但異質(zhì)程度卻不相同，表明不同品種的植物光合異質(zhì)性也存在強(qiáng)弱區(qū)別。而有時(shí)環(huán)境的變化甚至?xí)?dǎo)致光合異質(zhì)性發(fā)生強(qiáng)烈變化。XU等[32]的研究表明在自然狀態(tài)下雌雄異株的楊樹，兩性葉片Pn從葉尖到葉基逐漸下降。在鹽脅迫下雌株卻出現(xiàn)了相反的趨勢(shì)，表明不同類型的植物應(yīng)對(duì)不同環(huán)境變化采用的策略是不同的。本研究顯示在不同施肥處理下白樺同一葉片葉中的Pn要比葉基的Pn高一些，不同施肥處理兩者都具有較高的一致性。而除葉尖的Pn由于施肥處理后變化幅度較大并沒(méi)有與葉中、葉基的一致程度高外，不同施肥處理下白樺同一葉片的葉尖、葉中、葉基的Pn并沒(méi)有因?yàn)轲B(yǎng)分變化而發(fā)生差異規(guī)律的較大變化。葉尖的Pn均大于葉中與葉基以及葉中也略高于葉基的這種差異規(guī)律也沒(méi)有因?yàn)槭┓食霈F(xiàn)相反的趨勢(shì)，表明白樺葉片光合速率在不同養(yǎng)分添加的情況下其應(yīng)對(duì)方式變化不大，值得注意的是白樺葉片不同區(qū)域的光合與蒸騰間的關(guān)系也是不同的，說(shuō)明葉片氣體交換的異質(zhì)性也存在于光合與蒸騰的相關(guān)關(guān)系上。雖然本研究可以表明白樺不同區(qū)域葉片各項(xiàng)氣體交換之間存在差異性并且與葉片SD無(wú)關(guān)，但未能驗(yàn)證具體是什么原因?qū)е乱约澳姆N因素對(duì)其影響較大。分析白樺這種氣體交換異質(zhì)性的原因可能由于葉片不同區(qū)域的葉綠素含量、酶活性、養(yǎng)分吸收能力、以及內(nèi)部結(jié)構(gòu)與PSⅡ等的不同導(dǎo)致氣體交換異質(zhì)性的發(fā)生。因此在今后研究人員可以針對(duì)葉片不同區(qū)域的葉綠素含量、酶活性、養(yǎng)分吸收能力以及內(nèi)部結(jié)構(gòu)等進(jìn)行開創(chuàng)性的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法來(lái)驗(yàn)證葉片不同區(qū)域生理變化的原因。