天津地區(qū)草莓根腐病病原菌分離鑒定及室內毒力測定

姚玉榮 霍建飛 郝永娟 劉春艷 王萬立

摘要：草莓根腐病是草莓生產中的主要病害之一，且隨著草莓種植年限的增加而加重。明確草莓主要栽培地區(qū)根腐病致病菌種類，能夠正確指導草莓根腐病的防治。本研究采用組織分離法從天津市主要草莓種植基地草莓根腐病病株分離純化7個菌株。通過形態(tài)學和分子生物學鑒定，結果顯示引起草莓根腐病病原菌有兩種：膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）?？顾幮詼y定結果顯示戊唑醇對膠孢炭疽菌和尖孢鐮刀菌抑菌活性最好;苯醚甲環(huán)唑、咪鮮胺、吡唑醚菌酯、福美雙次之;氟唑菌酰胺、甲基硫菌靈對不同地區(qū)菌株的抑菌活性差異較大。

關鍵詞：草莓;根腐病;分離;鑒定;毒力測定

中圖分類號：S436.68+4文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2019）02-0107-04

Isolation and Identification of Strawberry Root Rot

Pathogen in Tianjin and Virulence Determination Indoor

Yao Yurong， Huo Jianfei， Hao Yongjuan， Liu Chunyan， Wang Wanli

（Tianjin Plant Protection Institute， Tianjin 30038?China）

AbstractStrawberry root rot is one of the main diseases occurring in strawberry production， which is aggravated with the increase of cultivation years. Exploring the pathogen species of strawberry root rot is useful for its effective control. By tissue isolation method， 7 fungal strains were separated and purified from strawberry root rot samples collected from main planting areas of strawberry in Tianjin. Through morphological and molecular biological identification， two strains were identified as Colletotrichum gloeosporioides and Fusarium oxysporum wich caused strawberry root rot disease. The results of virulence determination showed that tebuconazole had the best inhibitory effect， followed by difenoconazole， pyraclostrobin， prochloraz and thiram; the inhibitory effects of fluxapyroxad and thiophanate-methyl were different obviously among different regions.

KeywordsStrawberry; Root rot; Isolation; Identification; Virulence determination

草莓（Fragaria ananassa Duchense）為多年生宿根性草本植物，具有較高的經濟價值。近些年草莓產業(yè)發(fā)展迅速，隨著栽培面積日益增長，連作導致的土傳病害越來越嚴重，尤其是根腐病，嚴重影響草莓品質和產量，已經成為制約產業(yè)發(fā)展的關鍵因素。草莓根腐病主要危害莖基部和根部，嚴重時可造成整個草莓園的毀滅。

草莓根腐病是國內外草莓生產中難以防治的根部毀滅性病害，主要由鐮刀菌（Fusarium sp.）[1-3]、腐霉菌 （Pythium sp.）[4]、疫霉屬 （Phytophthora spp.）[5]、立枯絲核菌 （Rhizoctonia solani）[6， 7]、擬盤多毛孢菌 （Pestalotiopsis sp.）[8]以及炭疽菌屬（Colletotrechum sp.）[9， 10]等20多種土傳病原真菌復合侵染導致[11]。近些年研究者開始利用生防菌防治草莓根腐病，如木霉 （Trichoderma spp.）[12]、沙雷氏菌（Serratia plymuthica）[13]等，但是生產中草莓根腐病的防治仍然以化學防治為主。

不同地區(qū)不同品種草莓根腐病病原菌種類不盡相同，且隨著化學農藥的頻繁使用，病原菌抗藥性增強。因此全面了解天津地區(qū)草莓根腐病的病原菌種類及其對常用化學藥劑的抗性水平尤為重要。本研究對天津市主要草莓基地根腐病病原菌進行分離鑒定，并對病原菌抗藥性水平進行測定，以期為天津市草莓生產提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

草莓根腐病病樣于2017—2018年采集于天津市漢沽區(qū)大馬勺村、西青農博園、東麗區(qū)華明鎮(zhèn)、薊州區(qū)等主要草莓基地。

1.2病原菌的分離與純化

采用常規(guī)組織分離法，將新鮮的草莓根腐病病根沖洗干凈，剪取病健交界處0.5 cm節(jié)段，用0.5%次氯酸鈉浸泡30 s，無菌水清洗3次，滅菌紙吸干水分后用鑷子將其置于含有0.1 g·L-1氨芐青霉素的PDA培養(yǎng)基上，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，待長出菌絲，單孢純化，分離得到的菌株保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3病原菌分子鑒定

將病原菌接種到PDA培養(yǎng)基上，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待長出菌絲后，用CTAB法提取總DNA。采用真菌ITS序列通用引物ITS1和ITS4[14]?進行PCR擴增（ITS1： 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;ITS4： 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。PCR體系為：2×Es Taq Master Mix（Dye）25 μL，上下游引物各2 μL，DNA模板2 μL，ddH?2O 19 μL。擴增程序為：94℃ 4 ?min;94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 50 s，共35個循環(huán);72℃ 10 min。PCR擴增產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送天津金唯智生物科技有限公司測序。測序結果采用BLAST進行同源性分析。

1.4病原菌室內毒力測定

供試藥劑：100%氟唑菌酰胺，巴斯夫中國有限公司;98%吡唑醚菌酯，陜西美邦農藥有限公司;97%咪鮮胺，江蘇輝豐生物農業(yè)股份有限公司;96%戊唑醇、95.2%苯醚甲環(huán)唑，寧波三江益農化學有限公司;97%甲基硫菌靈，山東濰坊潤豐化工股份有限公司;98%福美雙，天津市農藥研究所。

病原菌室內毒力測定采用菌絲生長速率法。配制系列梯度濃度的含藥劑PDA平板，以等體積無菌水為對照。將培養(yǎng)好的病原菌菌塊（直徑5 mm）接種到上述平板上，恒溫25℃培養(yǎng)4 d，每個處理3個重復。采用十字交叉法測定菌落直徑，記錄并計算相對抑菌率。

1.5數據處理

試驗結果用DPS數據軟件進行處理，計算不同藥劑的毒力回歸方程、相關系數、致死中濃度EC?50值等。采用MEGA 5.0軟件對真菌ITS序列進行遺傳分析。

菌絲生長抑制率（%）=（空白對照菌落直徑增加值-藥劑處理菌落直徑增加值）/空白對照菌落直徑增加值×100[HT]

2結果與分析

2.1草莓根腐病形態(tài)學鑒定

根據病原菌在PDA培養(yǎng)基平板上菌落形態(tài)（圖1）及其菌絲和孢子形態(tài)（圖2），可以初步確定草莓根腐病病原菌為炭疽菌屬和鐮刀菌屬真菌。

2.2草莓根腐病病原菌分子鑒定結果

將測序結果進行BLAST序列比對，其中HG-1、HGDMS-3、DLHMZ-5、XQNBY-6四個菌株的序列與膠孢炭疽菌 （Colletotrichum gloeosporioides，DQ916151.1）相似性為99%～100%，HG-2、HGDMS-4、JZ-7三個菌株的序列與尖孢鐮刀菌 （Fusarium oxysporum f. sp. dianthi，LT841236.1）相似性為99% ～ 100%（圖3）。因此天津地區(qū)草莓根腐病病原菌主要是膠孢炭疽菌和尖孢鐮刀菌。

2.3草莓根腐病抗性測定

試驗篩選的7種殺菌劑對膠孢炭疽菌和尖孢鐮刀菌均有不同程度的抑制作用，其中戊唑醇的抑菌活性最好（表1）;其次是苯醚甲環(huán)唑、咪鮮胺、吡唑醚菌酯、福美雙;氟唑菌酰胺和甲基硫菌靈對不同地區(qū)菌株的抑菌活性差異較大，可能由于近幾年該殺菌劑在一些地區(qū)頻繁應用產生了一定的抗性。

3討論與結論

隨著草莓種植規(guī)模的日益擴大，種植年限增加，草莓根腐病已成為生產上難以解決的重要問題。目前以化學藥劑防治為主，但是由于草莓根腐病病原菌種類繁多，在制定綜合防治措施以及確定化學藥劑時，首先應明確主要病原菌的種類。

草莓根腐病致病因子極為復雜，各地區(qū)不同品種草莓致病菌的報道不盡相同。咸俊男等發(fā)現北京房山區(qū)草莓根腐病的主要病原菌為立枯絲核菌，化學藥劑甲基硫菌靈和殺毒礬、生物菌劑枯草芽孢桿菌、哈茨木霉和寡雄腐霉均對其具有較好的抑制作用[15]。韓國興測定了建德市楊村橋鎮(zhèn)的草莓膠孢炭疽菌對14種殺菌劑的抗藥性水平，其中代森錳鋅和吡唑醚菌酯的防治效果最好[16]。煙臺地區(qū)草莓根腐病病原菌包括尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）和疫霉菌（Phytophthora sp.），其中尖孢鐮刀菌和立枯絲核菌最為普遍[17]。Gerin等發(fā)現殼球孢菌（Macrophomina phaseolina）可引起草莓根腐病的發(fā)生，損失慘重[18]。

本試驗通過菌株形態(tài)學和分子生物學方法明確了引起天津地區(qū)草莓根腐病的病原菌主要為膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）和尖孢鐮刀菌（F. oxysporum），并測定了7種常用藥劑對天津地區(qū)草莓根腐病病原菌的敏感性，為天津地區(qū)草莓優(yōu)質安全生產提供了一定的參考依據。

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