石榴查爾酮合成酶蛋白的生物信息學分析

馮立娟 尹燕雷 楊雪梅 唐海霞 李英朋 鹿英

摘要：本研究用生物信息學方法對石榴及其他19個物種CHS蛋白的系統(tǒng)進化和motif元件進行分析，重點預測分析石榴、巨桉和擬南芥CHS蛋白的理化性質、氨基酸組成、磷酸化位點和二級結構。結果表明，石榴與巨桉親緣關系最近，與擬南芥最遠。石榴、巨桉和擬南芥CHS蛋白由20種氨基酸組成，數量和比例存在差異，石榴和擬南芥中亮氨酸數量最多，巨桉中丙氨酸最多;存在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸3個磷酸化結合位點，多數發(fā)生在蘇氨酸和絲氨酸位置上;二級結構由α-螺旋、延伸鏈、無規(guī)則卷曲和β-轉角構成，α-螺旋和無規(guī)則卷曲占比較高。在20個物種CHS蛋白的motif元件中，石榴CHS蛋白motif數量和位置與巨桉完全一致，與大多數物種相似，與擬南芥差異較大。本研究結果可為深入研究CHS生物學功能及其調控石榴果實呈色的機理提供理論依據。

關鍵詞：石榴; 花青苷;查爾酮合成酶;生物信息學

中圖分類號：S665.403文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2019）02-0007-06

Bioinformatics Analysis of CHS Protein in Pomegranate

Feng Lijuan??Yin Yanlei??Yang Xuemei??Tang Haixia??Li Yingpeng??Lu Ying3

（1.Shandong Institute of Pomology， Taian 271000， China;

2. Guan County Dianzi Forestry Station， Guanxian ?252525， China;

3.Shiheng Town Forestry and Fruit Station of Feicheng City， Feicheng 27161?China）

AbstractThe phylogenetic and motif elements of pomegranate and other 19 cultivars of CHS proteins were analyzed by bioinformatics methods in the study. The physicochemical properties， amino acid composition， phosphorylation sites and second structure of CHS proteins were emphatically analyzed in Punica granatum， Eucalyptus grandis and Arabidopsis thaliana. The results showed that Punica granatum had the closest relationship with Eucalyptus grandis and the farthest relationship with Arabidopsis thaliana. There were twenty amino acids in the CHS proteins of Punica granatum， Eucalyptus grandis and Arabidopsis thaliana， and the number and proportion were different. The leucine number was the highest in Punica granatum and Eucalyptus grandis， and alanine number was the highest in Arabidopsis thaliana. There were phosphorylation binding sites of serine， threonine and tyrosine， respectively， most of them existed in threonine and serine. The secondary structure was consist of alpha helix， extended strand， random coil and beta-turn， in which，the proportion of alpha helix and random coil were higher. In the motif elements of CHS protein of twenty cultivars， the number and location of CHS protein motifs in Punica granatum were identical to Eucalyptus grandis， similar to most cultivars， and significantly different from Arabidopsis thaliana. The results could provide theoretical bases for the further study on biological functions of CHS and mechanism of regulating the coloration of pomegranate fruit.

KeywordsPunica granatum; Anthocyanin; Chalcone synthase; Bioinformatics

查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）是植物類黃酮代謝途徑中關鍵限速酶之一，催化香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A合成柚皮素查爾酮，最終代謝成花青苷、黃酮醇和黃烷酮等類黃酮類物質[1-3]。CHS對植物的生長發(fā)育具有重要作用，不僅可以形成色素，還可以通過自身參與代謝調節(jié)活動并在一定程度上反映植物與環(huán)境間的相互關系[4，5]。CHS日益成為植物遺傳育種、抗逆等領域的研究熱點。

目前，桃[1]、葡萄[2]、杧果[3]和蘋果[6]等多種果樹中的CHS基因已被克隆出來，其表達水平受光照[7]、5-氨基乙酰丙酸[8]和機械損傷[9]的影響。石榴（Punica granatum L.）保健功能強，觀賞價值高，耐干旱，抗鹽堿，適應性廣，深受消費者喜愛，發(fā)展前景廣闊[10，11]。石榴中CHS基因已被克隆出來，其表達與果皮呈色密切相關[12，13]。但關于CHS蛋白生物信息學方面的分析較少，對其生物學功能未深入了解。因此，本研究以石榴CHS蛋白為研究對象，從系統(tǒng)進化、理化性質、磷酸化修飾、二級結構和motif元件等方面進行分析，以期為深入研究石榴果實呈色機理奠定理論基礎。

1材料與方法

1.1CHS蛋白系統(tǒng)進化樹的構建

通過NCBI數據庫搜索已登錄石榴CHS蛋白（序列號為ALT22073.1）的氨基酸序列，并通過Blastp檢索石榴與其他物種CHS蛋白的同源性。根據同源性高低選取不同的物種（表1），并利用DNAMAN 6.0軟件構建石榴與其他物種的系統(tǒng)進化樹。

1.2CHS蛋白生物信息學分析

用ExPasy提供的在線ProtParam軟件（http：//expasy.org./tools/protparam.html）進行氨基酸數目、組分、理論等電點、蛋白質親疏水性和穩(wěn)定性等分析。蛋白質磷酸化位點采用 NetPhos（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析，二級結構采用 SOPMA軟件（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）預測。利用在線MEME網站（http：//meme-suite.org/tools/meme）對CHS蛋白的氨基酸序列進行模序分析。設定參數最大寬度值為50，最小寬度值為6，模序量小于20個，其余參數的設置均為默許。

2結果與分析

2.1CHS蛋白系統(tǒng)進化樹構建

石榴與其他19個物種CHS蛋白的系統(tǒng)進化樹如圖1所示。該進化樹分為三大組，擬南芥單獨為一組，高粱單獨為一組，其他18個物種為一組。其中，18個物種組又分為三大類，碧桃、甜櫻桃、蘋果和砂梨為一類，果香菊單獨為一類，石榴、荔枝、龍眼、巨桉、葡萄、核桃、檸檬等13個物種聚為一類。由此可知，石榴與荔枝、龍眼、巨桉、葡萄CHS蛋白的親緣關系較近，與擬南芥、高粱的親緣關系較遠。巨桉和石榴同屬于桃金娘目植物，與其親緣關系較近，擬南芥是一種模式植物，與其親緣關系較遠。因此，本研究選擇巨桉、擬南芥與石榴CHS蛋白進行比對分析，進一步預測該蛋白功能的保守性與進化。

2.2CHS蛋白理化性質預測分析

由表2可知，ProtParam軟件預測石榴CHS蛋白由398個氨基酸組成，分子式為C?1939H?3107N?523O?573S?19，相對分子質量為43 523.30，理論等電點（pI）為7.14，帶負電荷的殘基總數（Asp+Glu）和正電荷的殘基總數均為47個;不穩(wěn)定系數為37.18，為穩(wěn)定蛋白;親疏水性為-0.122，為親水性蛋白。巨桉CHS蛋白由396個氨基酸組成，分子式為C?1912H?3051N?523O?573S?20，相對分子質量為43 174.62，理論等電點（pI）為6.10，帶負電荷的殘基總數（Asp+Glu）和正電荷的殘基總數分別為49個和44個;不穩(wěn)定系數為37.87，為穩(wěn)定蛋白;親疏水性為-0.119，為親水性蛋白。擬南芥CHS蛋白由395個氨基酸組成，分子式為C?1914H?3062N?522O?568S?20，相對分子質量為43 115.72，理論等電點（pI）為6.08，帶負電荷的殘基總數（Asp+Glu）和正電荷的殘基總數分別為49個和43個;不穩(wěn)定系數為32.16，為穩(wěn)定蛋白;親疏水性為-0.074，為親水性蛋白。

石榴、巨桉和擬南芥CHS蛋白共由20種不同的氨基酸組成，數量和比例存在一定差異（表3）。石榴和擬南芥中均是亮氨酸數量最多，分別為39個和40個，所占比例為9.8%和10.1%;巨桉中丙氨酸數量最多（40個），占比為10.1%。石榴、巨桉和擬南芥CHS蛋白中色氨酸數量最少，均為4個，占比均為1.0%。

2.3CHS蛋白磷酸化修飾預測分析

NetPhos 分析表明，石榴、巨桉和擬南芥CHS蛋白均存在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸3個磷酸化位點，且數量存在差異（圖2）。石榴中蘇氨酸（threonine）磷酸化位點有21個，絲氨酸（serine）?磷酸化位點有26個，酪氨酸（tyrosine）磷酸化位點有6個。巨桉中蘇氨酸磷酸化位點有21個，絲氨酸磷酸化位點有28個，酪氨酸磷酸化位點有6個。擬南芥中蘇氨酸磷酸化位點有19個，絲氨酸磷酸化位點有27個，酪氨酸磷酸化位點有3個。

2.4CHS蛋白二級結構預測分析

石榴、巨桉和擬南芥CHS蛋白預測的二級結構如圖3所示，均由α-螺旋、延伸鏈、無規(guī)則卷曲和β-轉角構成。石榴CHS蛋白中有176個氨基酸參與形成α-螺旋，占44.22%;有130個氨基酸參與形成無規(guī)則卷曲，占32.66%;有63個氨基酸參與形成延伸鏈，占15.83%;有29個氨基酸參與形成β-轉角，占7.29%。巨桉CHS蛋白二級結構以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，分別占40.66%和34.09%，延伸鏈和β-轉角分別占16.41%和8.84%。擬南芥CHS蛋白中α-螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈和β-轉角占的比例分別為47.09%、31.90%、14.43%和6.58%，α-螺旋和無規(guī)則卷曲占的比例較高。

2.5CHS蛋白motif元件預測分析

通過MEME在線預測motif元件結果如圖4和圖5所示，20個物種CHS蛋白motif數量變化為7～13個，類型存在差異。石榴、巨桉、木薯、毛果楊、高粱、果香菊和金銀花的motif元件數量為13個，石榴和巨桉的類型相同，木薯和毛果楊的類型僅有1個不同，高粱和果香菊的motif類型基本相同，只有1個不同。葡萄、荔枝、龍眼、麻瘋樹和荷花均存在12個motif元件，荔枝與龍眼、葡萄與荷花的類型基本相同，麻瘋樹與其它4個物種僅有1個類型不同。檸檬、甜橙、蘋果、砂梨、碧桃、甜櫻桃和核桃的motif數量為11個，類型基本相同。擬南芥motif數量為7個，類型與其它19個物種存在很大差異。由此進一步證明石榴與巨桉的親緣關系最近，與其它18個物種較近，與擬南芥較遠。

3討論與結論

隨著現(xiàn)代分子生物學技術的發(fā)展，石榴基因組已被國內外科研人員破譯出來，把石榴重新劃分為千屈菜科（Lythraceae），其分子特征與巨桉存在很多共性[14]。本研究通過分析石榴與其他19種植物CHS蛋白的系統(tǒng)進化關系發(fā)現(xiàn)，石榴與巨桉親緣關系最近，與擬南芥親緣關系最遠。巨桉屬于桃金娘科，和石榴同屬于桃金娘目植物，所以它們之間的遺傳關系較近。

蛋白質是生命活動的主要執(zhí)行者，磷酸化修飾是蛋白質翻譯后修飾的一種重要形式，蛋白質磷酸化在調節(jié)植物細胞增殖、發(fā)育、信號轉導、脅迫應答等活動中起重要作用[15]。本研究表明，石榴、巨桉和擬南芥CHS蛋白均存在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸3個磷酸化結合位點，多數發(fā)生在蘇氨酸和絲氨酸位置上，少數在酪氨酸位置上。CHS蛋白磷酸化后能改變其自身的活性，調節(jié)植物的生長發(fā)育過程[16]。

CHS在植物類黃酮生物合成途徑中起重要調控作用，受到科研工作者的廣泛關注。目前CHS基因序列已克隆出4 000余條，在苔蘚、蕨類、裸子植物和被子植物中均有報道[17]。本研究利用生物信息學方法對石榴CHS蛋白系統(tǒng)進化、理化性質、二級結構、motif元件等進行分析，闡明了其重要的分子特征，豐富了該蛋白的相關研究?；ㄇ嘬沾x受外界環(huán)境條件的影響很大，UV誘導能上調CHS基因的表達，促進花青苷的積累[18]。后續(xù)將深入分析光照、UV照射等對石榴果實葉色表達的影響，分析CHS的表達模式與花青苷代謝的關系，從而為深入揭示石榴果實呈色機理提供理論依據。

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