中藥蒲黃對(duì)急性脊髓損傷大鼠模型傷后行為能力的影響

孔 亮，朱文瀟，劉 蓓，王向陽(yáng)，韓 志，楊 磊，曹向陽(yáng)，崔宏勛

脊髓損傷是一種引起損傷平面以下運(yùn)動(dòng)感覺(jué)功能一定程度喪失的神經(jīng)性疾病。目前缺乏特效的治療手段，臨床上廣泛采用的是傷后早期手術(shù)減壓、甲強(qiáng)龍激素沖擊療法、物理治療等[1-3]。有研究表明，香蒲科植物蒲黃對(duì)脊髓損傷具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用[4-5]。本研究探討中藥蒲黃對(duì)急性脊髓損傷大鼠模型神經(jīng)功能恢復(fù)的影響，旨在為脊髓損傷的藥物治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只SPF級(jí)雌性SD大鼠[許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002；批號(hào)：43004700056215]，5周齡，體質(zhì)量（235±15）g，購(gòu)自湖南萊克斯景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。將所有大鼠置于室溫22℃～24℃、濕度50%～60%的自然光照環(huán)境中，進(jìn)食飲水自由。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建立急性脊髓損傷模型 采用Allen's法。首先配置體積分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛溶液，以300 mg/kg的劑量進(jìn)行腹腔注射。麻醉成功后碘伏消毒，于胸背部正中顯露T9～T12椎板，行T10～T11全椎板、T9和T12鄰近椎板切除，暴露硬脊膜，以鉗夾固定T9和T12棘突。將底部為凹面的塑料墊片覆蓋于T10～T11硬脊膜上，以避免二次損傷。取一10 g不銹鋼棒，從高10 cm處自由落下，擊打在所覆蓋的墊片上，造成大鼠急性脊髓損傷。若擊打后大鼠出現(xiàn)迅速搖尾反應(yīng)，雙后肢及軀體回縮撲動(dòng)，表明撞擊成功；觀察術(shù)后相應(yīng)節(jié)段脊髓，均表現(xiàn)出明顯的瘀血及水腫（圖1）。沖洗傷口并依次縫合硬脊膜、椎旁肌肉、筋膜和皮膚。肌注青霉素鈉10萬(wàn)U（2次/d，3 d）以避免感染。術(shù)后大鼠單籠飼養(yǎng)于相同環(huán)境中，術(shù)后4 h通過(guò)按摩膀胱行輔助排尿，此后每天輔助排尿2次，直到重新建立膀胱反射。

1.2.2 分組處理 隨機(jī)選取10只大鼠僅行椎板切除而不損傷脊髓，作為A組。其余40只造模成功的大鼠經(jīng)計(jì)算機(jī)隨機(jī)分為B、C、D、E組，每組10只。造模成功后即開(kāi)始灌胃，1次/d，維持5周，其中A、B組給予生理鹽水，C、D、E組分別按照1、5、10 g/kg的劑量標(biāo)準(zhǔn)給予蒲黃水煎液灌胃。

圖1 大鼠脊髓損傷造模后脊髓T10～T11節(jié)段呈明顯瘀血水腫

具體藥物配制方法：以白細(xì)布將生蒲黃（產(chǎn)地江蘇，由河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院藥劑科提供）按照低劑量（1 g/kg）、中劑量（5 g/kg）、高劑量（10 g/kg）包好，分別加蒸餾水100 mL文火煎煮30 min，留濾液，重復(fù)2次，將濾液混合后置于量杯中，加水稀釋至20 mL。在pH計(jì)（英國(guó)Jenway公司3510型）監(jiān)測(cè)下緩慢加入0.1 mol/L NaOH溶液，調(diào)整pH值至7～8后冷藏備用。

1.3 觀察指標(biāo)

將大鼠放入便于觀察的容器中，敲擊側(cè)壁，使其爬行，觀察髖、膝、踝3處關(guān)節(jié)活動(dòng)狀況。按照Basso Beattie Bresnahan（BBB）評(píng)分[6]評(píng)估大鼠脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能，0～7分為單一關(guān)節(jié)小幅度運(yùn)動(dòng)或無(wú)負(fù)重狀態(tài)下爪面朝地，8～13分為后肢不協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)，14～21分為移動(dòng)時(shí)前后肢具有一定協(xié)調(diào)性。造模成功后1 d開(kāi)始進(jìn)行首次評(píng)價(jià)，此后每周評(píng)價(jià)1次，持續(xù)5周。每次評(píng)價(jià)均由2名掌握BBB評(píng)分方法但未了解實(shí)驗(yàn)?zāi)康募胺纸M方法的研究人員完成，取平均分為最終分值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，同一時(shí)相點(diǎn)各組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，每組造模后不同時(shí)相點(diǎn)比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

造模后1～7 d，B、C、D、E組均未發(fā)現(xiàn)任何下肢活動(dòng)；14 d觀察到D、E組大鼠后肢出現(xiàn)輕微活動(dòng)，D、E兩組BBB評(píng)分分別與A、B 2組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；造模后21 d，C組出現(xiàn)后肢輕微活動(dòng)，D、E兩組活動(dòng)能力進(jìn)一步提高；造模后28 d，B組開(kāi)始出現(xiàn)關(guān)節(jié)輕微活動(dòng)，D、E兩組關(guān)節(jié)功能恢復(fù)較好，且E組可在非承重情況下爪面著地；造模后35 d，B、C兩組評(píng)分差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），C組運(yùn)動(dòng)情況未得到明顯改觀。D組、E組肢體功能進(jìn)一步改善，偶見(jiàn)D組非承重狀態(tài)下爪面著地，E組出現(xiàn)后肢協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)（P＜0.05）。造模后不同時(shí)相點(diǎn)各組BBB評(píng)分見(jiàn)表1。

3 討論

3.1 脊髓損傷后的繼發(fā)性損傷機(jī)制

Merli等[7]指出，創(chuàng)傷后機(jī)體于72 h內(nèi)達(dá)到高凝狀態(tài)，并維持7～10 d。這種高凝狀態(tài)很可能導(dǎo)致神經(jīng)組織細(xì)胞缺血性改變，阻礙神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)，引發(fā)細(xì)胞自噬、炎癥反應(yīng)等機(jī)制[8-9]，以致于更大范圍的神經(jīng)變性壞死，引起損害更重、影響更深遠(yuǎn)的繼發(fā)性損傷反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致脊髓損傷區(qū)域同側(cè)肢體的運(yùn)動(dòng)障礙，嚴(yán)重影響機(jī)體的自主行為活動(dòng)。

Yick等[10]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，C3及T1、T11的半橫斷損傷均可導(dǎo)致Clarker核神經(jīng)元的異常死亡，引起脊髓小腦束繼發(fā)性損傷；其中T1和T11損傷導(dǎo)致L1節(jié)段在5～10 d時(shí)最先出現(xiàn)Clarke核神經(jīng)元死亡，損傷20 d后這一狀況會(huì)逐漸減緩，至傷后40 d左右，脊髓小腦束繼發(fā)性損傷終止。故本研究設(shè)計(jì)建立大鼠T10～T11脊髓橫斷損傷模型，并將觀察周期限定在40 d以內(nèi)，在這一時(shí)間范圍內(nèi)測(cè)定的BBB評(píng)分在一定程度上可被認(rèn)為是觀察對(duì)象的結(jié)局。

表1 蒲黃溶液處理組與對(duì)照組脊髓損傷模型大鼠造模后BBB評(píng)分比較（±s，n=10，分）

表1 蒲黃溶液處理組與對(duì)照組脊髓損傷模型大鼠造模后BBB評(píng)分比較（±s，n=10，分）

注：BBB評(píng)分：Basso Beattie Bresnahan評(píng)分；*：與A組比較，P ＜0.05；#：與B組比較，P ＜0.05A組：假手術(shù)對(duì)照組；B組：生理鹽水對(duì)照組；C組：低劑量組；D組：中劑量組；E組：高劑量組

組別A組B組C組D組E組1 d 17.4±0.5 0.0±0.0*0.0±0.0*0.0±0.0*0.0±0.0*7 d 20.6±0.8 0.0±0.0*0.0±0.0*0.0±0.0*0.0±0.0*14 d 21.0±0.6 0.0±0.0*0.0±0.0*1.0±0.9*#0.6±0.5*#21 d 21.0±0.6 0.0±0.0*1.4±0.5*#3.4±1.4*#3.4±1.0*#28 d 21.0±0.6 0.4±0.5*2.4±0.5*5.0±1.8*#7.4±3.0*#35 d 21.0±0.6 0.4±0.5*3.0±0.6*6.6±1.4*#9.4±3.6*#F值29.794 0.487 5.905 51.501 34.120 P值0.001 0.781 0.003 0.001 0.001

3.2 蒲黃的藥物作用及其治療脊髓傷后繼發(fā)性損傷的機(jī)制

傳統(tǒng)中藥蒲黃具有止血和消腫化瘀的功效，近年來(lái)有研究證實(shí)，炮制后的蒲黃炭可明顯縮短小鼠活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial prothrombin time，APTT），而生蒲黃則可顯著延長(zhǎng)小鼠APTT，大劑量下可促進(jìn)纖維蛋白溶解[11]，改善脊髓損傷導(dǎo)致的機(jī)體高凝狀態(tài)，為神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)清除障礙。此外，Wang等[4]還發(fā)現(xiàn)中藥蒲黃可有效降低脊髓損傷組織中LC3、Beclin-1、mTOR和Akt的蛋白濃度，從而抑制細(xì)胞的自噬和免疫反應(yīng)。

3.3 炮制工藝對(duì)蒲黃藥物作用的影響

作為傳統(tǒng)中藥，蒲黃最初僅以生蒲黃直接入藥和焙至微黃服用2種方法，后又出現(xiàn)蒲黃炭的炮制工藝[12]。周習(xí)等[13]通過(guò)色譜法和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)生蒲黃相較于蒲黃炭具有更優(yōu)的活血作用，可明顯改善血液循環(huán)。本研究采用的蒲黃水煎液是以生蒲黃的傳統(tǒng)炮制方法制備，能夠最大限度地發(fā)揮蒲黃的抗凝作用，加速脊髓損傷及其鄰近區(qū)域的血液微循環(huán)，促進(jìn)大鼠模型的傷后恢復(fù)。

3.4 蒲黃對(duì)急性脊髓損傷大鼠模型傷后行為能力的影響

本實(shí)驗(yàn)中大鼠在脊髓損傷造模后均失去后肢活動(dòng)能力，而中、高劑量組大鼠在2周后率先出現(xiàn)后肢關(guān)節(jié)的輕微活動(dòng)，低劑量組在3周后也出現(xiàn)該跡象，生理鹽水對(duì)照組4周時(shí)方有輕微的后肢活動(dòng)。損傷后第5周，高劑量組中部分個(gè)體可進(jìn)行后肢掌面的承重活動(dòng)，中劑量組中最好者可達(dá)到非承重狀態(tài)下的掌面觸地，兩組均明顯優(yōu)于僅一兩個(gè)關(guān)節(jié)可輕微活動(dòng)的生理鹽水對(duì)照組。而低劑量組整體結(jié)果與生理鹽水對(duì)照組間的差異雖不顯著，但個(gè)別大鼠可恢復(fù)至三個(gè)關(guān)節(jié)的輕微活動(dòng)。在王衛(wèi)國(guó)等[14]的研究中，使用低劑量蒲黃的試驗(yàn)組第五周即發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組存在顯著性差異。而本研究中C組與生理鹽水對(duì)照組差異始終無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)可能是由于給藥方式不同，灌胃相比于腹腔注射更貼近于患者實(shí)際使用場(chǎng)景，后期應(yīng)進(jìn)行更大樣本試驗(yàn)或針對(duì)蒲黃的吸收機(jī)制進(jìn)行探究?？傊?，注射蒲黃實(shí)驗(yàn)組大鼠在起始恢復(fù)時(shí)間和最終功能評(píng)價(jià)方面均優(yōu)于生理鹽水對(duì)照組，且隨劑量升高，表現(xiàn)更佳，二者與蒲黃注射液的濃度亦可能存在正相關(guān)關(guān)系，這些結(jié)果提示，中藥蒲黃在促進(jìn)脊髓功能恢復(fù)和阻止脊髓損傷范圍擴(kuò)大方面可能起到顯著的治療作用。

3.5 不足之處

脊髓損傷的恢復(fù)涉及凝血機(jī)制、細(xì)胞自噬機(jī)制、免疫機(jī)制等[15-17]，僅凝血機(jī)制尚不能完全解釋脊髓恢復(fù)的全過(guò)程；而在實(shí)驗(yàn)后期，大鼠行為能力的恢復(fù)受康復(fù)運(yùn)動(dòng)因素正反饋?zhàn)饔玫挠绊慬18]，其作用大小尚未可知，可能會(huì)對(duì)結(jié)果造成一定偏倚；本研究亦未考慮不同產(chǎn)地來(lái)源的蒲黃有效成分可能存在差異以及大鼠樣本量帶來(lái)的偏倚?？傊敬窝芯繌膭?dòng)物實(shí)驗(yàn)角度初步論證蒲黃對(duì)于急性脊髓損傷的治療作用，為脊髓損傷的藥物治療選擇提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。