猴頭菇不同活性部位體外抗氧化活性研究

吳美媛，王喜周，周英，王超，許維丹

（麗水學(xué)院成教學(xué)院，浙江麗水 323000）

猴頭菇（Hericium erinaceus），又名猴頭蘑、熊頭菇、刺猬菇，錄屬于擔(dān)子菌門(mén)，猴頭菌科，是著名的藥食兩用菌。猴頭菇性平，味甘，能利五臟，助消化，具健胃，益精，補(bǔ)虛，抗癌之功效。現(xiàn)代研究表明猴頭菇可增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗?jié)儭⒖鼓[瘤及延緩衰老等多種作用[1-2]。

自由基是生物體氧化過(guò)程中產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物，與機(jī)體衰老有密切關(guān)系，機(jī)體不斷產(chǎn)生和清除自由基，以保持動(dòng)態(tài)平衡。如果機(jī)體產(chǎn)生自由基的能力超出了清除能力，自由基就會(huì)直接或間接地引起蛋白質(zhì)變性、多糖降解、DNA 斷裂，造成細(xì)胞損傷或死亡[3]，補(bǔ)充清除機(jī)體自由基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)維護(hù)人體健康，延緩衰老有很大的意義[4]。本課題以抗氧化活性為指標(biāo)，篩選了猴頭菇的提取溶劑，制備出具有優(yōu)良抗氧化活性的提取物，同時(shí)為猴頭菇功能食品的開(kāi)發(fā)提供了參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

BS124S 電子天平（Sartorius）；LZ-26 薄膜蒸發(fā)濃縮器（廈門(mén)化工醫(yī)藥機(jī)械廠）；DL-6000B 離心機(jī)（湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；Shimadzu2450 紫外可見(jiàn)分管光度計(jì)（日本島津公司）。

1.2 試劑

猴頭菇細(xì)粉：100 目，浙江方格藥業(yè)有限公司；ABTS試劑：singma；DPPH 試劑：singma；丙酮、乙醇、水楊酸、硫酸亞鐵、雙氧水、磷酸一氫鈉、磷酸二氫鈉：均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2 方法

2.1 樣品溶液制備

分別用水、50%乙醇和丙酮提取猴頭菇。水提取物：稱取猴頭菇細(xì)粉20 g，置于500 mL 圓底燒瓶中，加30 倍蒸餾水，100°C 浸提3 h，過(guò)濾，濾液減壓濃縮，即得水提取物；醇提取物：稱取猴頭菇細(xì)粉20 g，置于500 mL 圓底燒瓶中，加15 倍50 %乙醇，75 °C 浸提1.5 h，過(guò)濾，濾液減壓濃縮，即得醇提取物；丙酮提取物：稱取猴頭菇細(xì)粉20 g，置于500 mL 圓底燒瓶中，加15 倍丙酮，55°C 浸提1.5 h，過(guò)濾，濾液減壓濃縮，即得丙酮提取物。

稱取水提取物、乙醇提取物、丙酮提取物各2.0 g，分別用相應(yīng)的溶劑將其配置成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mg/mL 的樣品溶液，備用。

2.2 體外抗氧化活性測(cè)定

分別測(cè)定猴頭菇水提物、乙醇提取物及丙酮提取物對(duì)·OH 自由基、DPPH·自由基及ABTS+自由基的清除能力，數(shù)據(jù)采用SPSS16.0 處理，組間比較采用方差分析和t 檢驗(yàn)。

2.2.1 ·OH 自由基清除能力測(cè)定

分別取不同濃度樣品2 mL 于試管中，依次加入6 mmol/LFeSO4，6 mmol/LH2O2各2mL，搖勻，靜置10min，再加6mmoL/L 水楊酸2mL，搖勻，靜置30min，于510nm處測(cè)定Ai，以蒸餾水代替6 mmoL/L 水楊酸，測(cè)得Aj，以蒸餾水代替樣品測(cè)定A0，重復(fù)3 次，按下式計(jì)算·OH自由基抑制率[5]。

式中：Ai、Aj、A0分別代表樣品組、樣品空白組及對(duì)照組的吸光度。

2.2.2 DPPH·自由基清除能力測(cè)定

分別取不同濃度樣品2 mL 于試管中，加入2 mL 2×10-4moL/L 的DPPH 的無(wú)水乙醇溶液，混合均勻，暗處反應(yīng)30 min 后于517 nm 處測(cè)定Ai，以無(wú)水乙醇代替2×10-4moL/L DPPH 測(cè)得Aj，以蒸餾水代替樣品溶液測(cè)得A0，重復(fù)3 次，按下式計(jì)算DPPH·自由基清除百分率。

式中：Ai、Aj、A0分別代表樣品組、樣品空白組及對(duì)照組的吸光度。

2.2.3 ABTS+自由基清除能力測(cè)定

取ABTS 10 mg，K2S2O82.9 mg 溶于10 mL 0.01 moL/L磷酸鈉緩沖液中，25 ℃避光儲(chǔ)存16 h～18 h，備用。實(shí)驗(yàn)當(dāng)日取ABTS 液2 mL 加18 mL 0.01 moL/L 磷酸鈉緩沖液，調(diào)節(jié)吸光度在734 nm 處為0.7。分別取0.2 mL不同濃度樣品于試管中加3.8 mL 上述ABTS 分析液，6 min 后734 nm 測(cè)得Ai，以蒸餾水代替ABTS 分析液測(cè)得Aj，以蒸餾水代替樣品溶液測(cè)得A0，重復(fù)3 次，按下式計(jì)算ABTS+自由基清除百分率。

式中：Ai、Aj、A0分別代表樣品組、樣品空白組及對(duì)照組的吸光度。

3 結(jié)果與討論

3.1 提取物得率

熱水、乙醇和丙酮提取物得率分別為：（4.15±0.49）%、（7.35±0.58）%和（5.33±0.61）%。

3.2 體外抗氧化活性測(cè)定

3.2.1 對(duì)·OH 自由基的清除作用

H2O2與Fe2+混合產(chǎn)生·OH，在反應(yīng)體系中加入水楊酸，能有效捕捉·OH，從而生成2，3-二羥基苯甲酸，該產(chǎn)物在510 nm 處有強(qiáng)吸收，若有抗氧化物質(zhì)加入，便會(huì)與水楊酸競(jìng)爭(zhēng)，從而使有色產(chǎn)物的生成量減少。因此在510 nm 處比色，可以評(píng)價(jià)受試物清除·OH 的能力。猴頭菇不同溶劑提取物對(duì)·OH 自由基的清除作用見(jiàn)圖1。

圖1 ·OH 自由基的清除作用Fig.1 ·OH radical scavenging capacity of VCand the different solvents extraction

由圖1 可見(jiàn)3 種溶劑提取物對(duì)·OH 自由基都有一定的清除作用，并表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系，各濃度下，乙醇提取物對(duì)·OH 自由基的清除作用均顯著高于熱水及丙酮提取物（P＜0.01），在2.0 mg/mL 時(shí)，熱水、乙醇及丙酮提取物對(duì)·OH 自由基的清除率分別為（51.53±1.83）%、（65.64±1.97）%和（37.28±2.12）%。

3.2.2 對(duì)DPPH·自由基的清除作用

DPPH 是一種穩(wěn)定的自由基，在有機(jī)溶劑中呈紫色，在517 nm 波長(zhǎng)處有較大吸收，當(dāng)加入抗氧化劑時(shí)，一部分自由基被清除掉，使該波長(zhǎng)下吸收強(qiáng)度減弱，可借此來(lái)評(píng)價(jià)某物質(zhì)的抗氧化活性。猴頭菇不同溶劑提取物對(duì)DPPH·自由基的清除作用見(jiàn)圖2。

結(jié)果可知3 種溶劑提取物對(duì)DPPH·自由基都有一定的清除作用，且隨著濃度的增大清除能力增強(qiáng)。乙醇提取物和丙酮提取物對(duì)DPPH·自由基的清除作用無(wú)顯著性差異（P＞0.05），在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL 濃度范圍內(nèi)，熱水提取物對(duì)DPPH·自由基清除作用顯著優(yōu)于乙醇及丙酮提取物（P＜0.01），在2.0 mg/mL 時(shí)熱水、乙醇及丙酮提取物對(duì)DPPH·自由基的清除力無(wú)差異（P＞0.05），清除率分別為（60.2 ±2.07）%，（62.15±2.23）%和（59.16±1.74）%。

圖2 DPPH·自由基的清除作用Fig.2 DPPH·radical scavenging capacity of VCand the different solvents extraction

3.2.3 對(duì)ABTS+自由基的清除作用

ABTS 作為一種間接檢測(cè)方法，使用范圍最廣泛，ABTS 經(jīng)氧化后生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色陽(yáng)離子自由基ABTS+，能溶于水相或酸性乙醇介質(zhì)中，在734 nm 處有最大吸收，可用于親水性和親脂性物質(zhì)抗氧化能力測(cè)定。被測(cè)物質(zhì)加入ABTS+溶液后，所含抗氧化成分能與ABTS+發(fā)生反應(yīng)而使反應(yīng)體系褪色。在ABTS+的最大吸收波長(zhǎng)734 nm 處檢測(cè)吸光度的變化，可用于測(cè)定樣品對(duì)ABTS+自由基的清除能力。猴頭菇不同溶劑提取物對(duì)ABTS+自由基的清除作用見(jiàn)圖3。

圖3 ABTS+自由基的清除作用Fig.3 ABTS+radical scavenging capacity of VCand the different solvents extraction

結(jié)果可知3 種溶劑提取物對(duì)ABTS+自由基都有一定的清除作用，且隨著濃度的增大清除能力增強(qiáng)。在各濃度下乙醇提取物顯對(duì)ABTS+自由基清除作用著優(yōu)于丙酮提取物（P＜0.01），在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL 濃度范圍內(nèi)，乙醇提取物與熱水提取物無(wú)顯著性差異（P＞0.05），當(dāng)濃度為2.0 mg/mL 時(shí)，乙醇提取物對(duì)ABTS+自由基的清除能力顯著優(yōu)于熱水提取物（P＜0.01）。熱水、乙醇及丙酮提取物對(duì)ABTS+自由基的清除率分別為（52.06±2.31）%、（63.84±1.72）%，（49.59±2.16）%，結(jié)果表明乙醇提取物對(duì)ABTS+自由基清除作用最好。

4 結(jié)論

本研究比較猴頭菇的熱水、乙醇及丙酮提取物的體外抗氧化能力，以·OH 自由基、DPPH·自由基和ABTS+自由基的清除率為指標(biāo)，篩選合適的提取溶劑，制備出具有較好抗氧化活性的提取物。研究結(jié)果表明以乙醇作為提取溶劑，制備提取物對(duì)·OH 自由基、DPPH·自由基及ABTS+自由基均表現(xiàn)出良好的清除能力，僅在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL 的較低濃度下，水提物對(duì)DPPH·自由基的清除優(yōu)于乙醇提取物，但是在較高濃度2 mg/mL 濃度下，醇提物對(duì)DPPH·自由基的清除率略高于水提物。

以體外藥理活性為導(dǎo)向，比較猴頭菇不同的提取溶劑的抗氧化效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙醇為最佳溶劑，本研究為猴頭菇保健品開(kāi)發(fā)提供思路和參考。

[1]Su X Y,Wang Z Y,Liu J R.In vitro and in vivo antioxidant activity of Pinuskoraiensis seed extract containing phenolic compounds[J].Food chemistry,2009,117(4)：681-686

[2]杜志強(qiáng),楊晨晨,王建英.猴頭菇多糖對(duì)小鼠血清抗氧化能力的影響[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2011,32(9)：57-59

[3]Knight J A.Diseases related to oxygen-derived free radicals[J].Annals of clinical and laboratory seience,1995,25(2)：111-121

[4]Yun Z F,Sheng Y,Guoyao W.Free radicals,antioxidants,and nutrition[J].Nutrition,2002,18(10)：872-879

[5]方玉梅,張春生,譚萍,等.金針菇黃酮類(lèi)化合物的抗氧化性作用[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2012,33(3)：15-18