褪黑素預(yù)處理提高多年生黑麥草抗旱性的機(jī)理分析

李本峰，杜紅梅

（上海交通大學(xué)設(shè)計(jì)學(xué)院，上海 200240）

水資源短缺已成為全球共同面對的難題，通過一定的方法和手段來提高植物的抗旱性不僅可以有效應(yīng)對水資源短缺的問題，還有利于植物的生產(chǎn)和推廣。多年生黑麥草(Lolium perenne)是一種優(yōu)質(zhì)的牧草和草坪草，但由于需水量大，抗旱性差，影響了多年生黑麥草在生產(chǎn)中的推廣和應(yīng)用。因此，采用一定的措施提高多年生黑麥草的抗旱性，并分析其抗旱性提高的機(jī)理，具有重要的意義。褪黑素(melatonin, MT)是一種色胺類小分子物質(zhì)[1-2]?，F(xiàn)已證明，所有的高等植物、低等植物和植物的主要器官，如花、葉和果實(shí)等都含有MT[3]。MT在植物中的主要作用是調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育、維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性、抑制葉綠素的分解和提高機(jī)體的抗氧化能力等[2]。

關(guān)于MT在草坪上的應(yīng)用研究，Shi等[4]利用不同濃度的MT預(yù)處理狗牙根(Cynodon dactylon)，再進(jìn)行脅迫處理，發(fā)現(xiàn) 20 μmol·L-1的 MT 溶液顯著提高了狗牙根對于鹽脅迫、干旱脅迫和冷脅迫的抗性，這可能與MT處理顯著降低了脅迫后期的活性氧含量，提高了過氧化物酶(peroxidase, POD)、超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)的活性，并且上調(diào)了與氮代謝、碳水化合物代謝、三羧酸循環(huán)相關(guān)的基因的表達(dá)有關(guān)。在干旱脅迫下，隨著細(xì)胞失水，植物會主動(dòng)積累一些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以維持滲透平衡，減少脅迫損傷。這些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)主要是小分子化合物，包括氨基酸、有機(jī)酸和糖等。近年來，許多技術(shù)，例如氣相色譜(gas chromatography,GC)、液相色譜、高分辨率的核磁共振和質(zhì)譜(mass spectrometry, MS)技術(shù)，已經(jīng)被成功用于干旱脅迫條件下差異代謝產(chǎn)物的分析。在這些方法中，GC-MS不僅簡單，而且分辨率高[5]。關(guān)于干旱脅迫條件下，MT處理對多年生黑麥草過氧化脅迫以及代謝產(chǎn)物積累的影響，以及與多年生黑麥草抗旱性的關(guān)系，未見報(bào)道。通過前面試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MT預(yù)處理對多年生黑麥草的抗旱性有顯著影響，其中 25、50、75 μmol·L-1MT 溶液在干旱脅迫前連續(xù)澆灌3 d，可以顯著提高多年生黑麥草的抗旱性 ， 但 25、 50、 75 μmol·L-1處 理 之 間 無 顯 著 差異[6]。因此本研究選取 25 μmol·L-1MT 溶 液 預(yù) 處理，從過氧化清除機(jī)制以及代謝產(chǎn)物積累角度，分析MT預(yù)處理提高多年生黑麥草抗旱性的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及生長條件

選用北京克勞沃種子公司提供的進(jìn)口多年生黑麥草品種‘百靈鳥'(千粒重為2.3 g)。將草種均勻撒播于直徑16 cm、深14 cm、底部帶有出水口的塑料花盆中，每盆播種1g，播種基質(zhì)體積比為2∶1的園土和河沙，每立方米基質(zhì)混入1 kg的復(fù)合肥 (N∶P∶K=15∶6.5∶8.3)。發(fā)芽后，置于上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院農(nóng)業(yè)工程訓(xùn)練中心的溫室大棚內(nèi)培育60 d，溫室白天溫度為15～25 ℃，夜晚溫度為15 ℃，相對濕度為60%～80%，光照強(qiáng)度為600μmol·(m2·s)-1。生長過程中，每周修剪2次，留茬高度為6 cm，澆水2次，澆至有水從排水口中排出為止。每周澆1次1/2Hoagland's營養(yǎng)液，每次每盆澆150 mL。然后移至人工氣候箱(HP1000GS型，武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司)內(nèi)，適應(yīng)7d后開始試驗(yàn)處理，氣候箱內(nèi)溫度為 (25±1)℃/(20±1)℃(晝溫/夜溫)，相對濕度60%，光周期14h，光照強(qiáng)度 320 μmol·(m2·s)-1。

1.2 試驗(yàn)方法

選取長勢一致的黑麥草，隨機(jī)分為4組，每組重復(fù)4次，每盆1個(gè)重復(fù)，開始進(jìn)行褪黑素處理，對照和處理的MT溶液澆灌量均為100 mL。褪黑素處理期間，為了保證干旱處理和對照的一致性，停止?jié)补郒oagland's營養(yǎng)液，并按照留茬高度，對不同處理統(tǒng)一進(jìn)行修剪。

對照處理（CK）∶以 0 μmol·L-1MT 溶液連續(xù)澆灌3 d后，開始正常的灌水；處理MCK：以25 μmol·L-1MT溶液連續(xù)澆灌3d后，進(jìn)行正常的灌水；處理 D：以0μmol·L-1MT 溶液連續(xù)澆灌3d后，停止灌水，開始干旱處理；處理MD：以25μmol·L-1MT溶液連續(xù)澆灌3d后，開始干旱處理。干旱處理11 d后復(fù)水。在干旱處理的0、4、11d和復(fù)水后的第1天，取多年生黑麥草的倒數(shù)第2片葉測定相關(guān)指標(biāo)，丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、抗氧化酶活性以及代謝產(chǎn)物分析的樣品凍存在-80 ℃冰箱中。

1.2.1 褪黑素溶液的配置

稱取 0.232 g MT，溶解至 5 mL 100% 的酒精中，再加入去離子水，定容至 250 mL，配成 4 mmol·L-1的 MT 母液，再用去離子水稀釋成 25 μmol·L-1的MT溶液。同時(shí)加入 0.05% (V∶V)的吐溫-20 ℃[7]。

1.2.2 相關(guān)生理指標(biāo)的測定

草坪質(zhì)量 (turf quality, TQ)用來評價(jià)草坪草的總體質(zhì)量表現(xiàn)[8]，具體從草坪草顏色、均一性、密度和質(zhì)地來評定，采用9分制。0分代表死亡、干枯的草坪草；9分代表綠色、緊致、完美的草坪草；6分代表草坪質(zhì)量可以接受。光化學(xué)效率(photochemical chemical efficiency)， 即 光 系 統(tǒng) II最大光化學(xué)量子產(chǎn)量，是可變熒光與最大熒光的比值，用Fv/Fm來表示。將材料放在暗室中暗適應(yīng)30 min后，采用雙通道調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x(Dual-PAM-100, 德國 WALZ公司)的熒光成像系統(tǒng)，利用DualPAM軟件對整盆植株進(jìn)行熒光成像，取所有像素點(diǎn)的均值作為該盆植株的Fv/Fm[9]。葉片的相對 含 水 量 (relative water content, RWC)采 用 Barrs和Weatherley[10]描述的方法進(jìn)行測定。采用Blum和Ebercon[11]的方法，用不同處理時(shí)間葉片的電解質(zhì)外率 (electrolyte leakage, EL)表示相對電導(dǎo)率的大小。

1.2.3 丙二醛和抗氧化酶活性測定

將凍存的多年生黑麥草樣品0.25 g液氮研磨后，采用pH 7.8的磷酸緩沖液提取，低溫離心后，上清液用于可溶性蛋白、MDA含量和抗氧化酶活性分析?？扇苄缘鞍缀坎捎每捡R斯亮藍(lán)G-250染色法測定[12]。采用硫代巴比妥酸法，測定不同處理?xiàng)l件下葉片中的MDA的含量[13]。SOD活性測定參照Giannopolitis和Ries[14]的方法進(jìn)行。SOD酶活性的表示方法為，吸光度560 nm條件下，抑制NBT光還原50%為一個(gè)酶活性單位。CAT和 POD活性測定參照 Chance和 Maehly[15]、Du等[16]的方法進(jìn)行，CAT活性的表示方法為吸光度每分鐘變化1視為一個(gè)酶活性單位，POD活性的表示方法為吸光度每分鐘變化0.1視為一個(gè)酶活性單位。

1.2.4 代謝產(chǎn)物的提取、分離和定量

將凍存的葉片樣品0.1 g置于研缽中，加入適量的液氮研磨成凍干粉，待液氮完全揮發(fā)，分次加入3 mL 80%甲醇提取液研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入到10 mL 的離心管中，再加入 30 μL 2 mg·mL-1的核糖醇，充分振蕩后，70 ℃ 水浴 20 min，然后 5 000 g離心 10 min，吸取 1.5 mL 上清液至 10 mL 離心管中，再加入1.4 mL蒸餾水和0.75 mL氯仿，充分振蕩后，吸取上清液1.6 mL至HPLC管中，濃縮(LNGT88臺式快速離心濃縮干燥器，太倉市華美生化儀器廠)干燥。濃縮干燥后加入 80 μL 15 mg·mL-1甲氧胺吡啶，密封置于30 ℃恒溫箱中甲氧基化1.5 h。甲氧基化結(jié)束后，加入 80 μL BSTFA∶TMCS(99∶1)，80 μL 吡啶，70 ℃ 硅烷化 1 h。

GC-MS方法根據(jù)Qiu等[17]的方法并稍加修改。硅烷化后的樣品用美國安捷倫公司7890-5975型GCMS 聯(lián)用儀進(jìn)行分析。色譜柱為 DB-5MS (30 m ×0.25 mm × 0.25 μm)。不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量 1 μL。GC進(jìn)樣口溫度260 ℃，穩(wěn)定5 min。色譜柱起始溫度 80 ℃，樣品注入 2 min 后色譜柱溫度以 5 ℃·min-1的速度上升到 280 ℃。離子源溫度200 ℃。載氣為氦氣，載氣流速 1 mL·min-1。溶劑延時(shí) 3 min，電子碰撞電離電壓70 eV，質(zhì)譜全掃描范圍(m/z∶30-550)進(jìn)行檢測。

GC-MS分析得到的總離子流色譜圖，采用安捷倫公司NIST 2011譜庫進(jìn)行檢索。使用核糖醇作為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算代謝產(chǎn)物的相對含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

試驗(yàn)采用完全區(qū)組設(shè)計(jì)。應(yīng)用SPSS軟件，在P= 0.05的水平上，采用Fisher's最小顯著差數(shù)法對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。文章中的圖采用SigmaPlot 10.0 軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 對多年生黑麥草草坪質(zhì)量、光化學(xué)效率和葉片相對含水量的影響

在干旱處理4 d時(shí)，干旱處理組草坪草的TQ顯著下降 (P＜0.05)，處理至 11 d 時(shí)，TQ 繼續(xù)下降，而在復(fù)水后干旱處理組的TQ上升。與不加MT的處理相比，干旱處理?xiàng)l件下，25 μmol·L-1的 MT 溶液預(yù)處理顯著增加了多年生黑麥草的TQ(圖1)。與TQ的變化趨勢一致，長時(shí)間的干旱脅迫顯著影響了多年生黑麥草的Fv/Fm和RWC(P＜0.05)，而在干旱脅迫條件下，25 μmol·L-1的 MT 溶液預(yù)處理顯著抑制了干旱脅迫對多年生草坪草Fv/Fm和RWC的

影響。復(fù)水后，25 μmol·L-1的 MT 溶液預(yù)處理又顯著促進(jìn)了Fv/Fm和RWC的上升(P＜0.05)，與干旱處理組相比，25 μmol·L-1的 MT 溶液預(yù)處理后，復(fù)水后Fv/Fm和RWC分別增加了54.85%和125.36%。

2.2 對多年生黑麥草細(xì)胞膜穩(wěn)定性和丙二醛含量的影響

電解質(zhì)外滲的增加一般被認(rèn)為是植物細(xì)胞膜受到破壞的結(jié)果。干旱脅迫條件下，多年生黑麥草葉片的EL值顯著增加(P＜0.05)，尤其是在干旱脅迫 11 d 時(shí)，而 25 μmol·L-1的 MT 溶液預(yù)處理顯著抑制了干旱脅迫條件下EL值的上升(P＜0.05)。在干旱脅迫4 d和11 d時(shí)，與干旱處理組相比，25 μmol·L-1的 MT溶液預(yù)處理后，EL值分別下降27.02%和13.89%。而在復(fù)水后，與干旱處理組相比，25 μmol·L-1的 MT 溶液預(yù)處理后 EL 值顯著降低 (P＜0.05)，比對照組下降了 56.50%(圖 2)。MDA是衡量細(xì)胞膜過氧化的重要指標(biāo)。干旱脅迫導(dǎo)致了多年生黑麥草葉片中MDA積累，而MT處理一定程度上減少了葉片中MDA的積累。在干旱脅迫11 d和復(fù)水1 d后，與干旱處理組相比，MT處理顯著降低了葉片中MDA的含量(P＜0.05)，分別降低了58.85%和65.08%(圖2)。

圖 2 褪黑素溶液預(yù)處理對多年生黑麥草葉片電解質(zhì)外滲和丙二醛含量的影響Figure 2 Effect of melatonin pretreatments on electrolyte leakage and malondialdehyde content in the leaves of perennial ryegrass (Lolium perenne)

2.3 對多年生黑麥草抗氧化相關(guān)酶活性的影響

25 μmol·L-1MT 溶液預(yù)處理顯著影響了干旱脅迫條件下多年生黑麥草抗氧化相關(guān)酶的活性。干旱脅迫4 d時(shí)，與未干旱處理相比，干旱處理組多年生黑麥草的 SOD 活性顯著增加 (P＜0.05)。11 d的干旱脅迫導(dǎo)致了SOD活性顯著下降(P＜0.05)；

復(fù)水 1 d ，SOD 活性回升。在干旱脅迫 4 d、11 d和復(fù)水1 d時(shí)，MT預(yù)處理均顯著增加了多年生黑麥草的 SOD 活性 (P＜0.05)(圖 3)。干旱處理組的CAT 活性在 4 d 和 11 d 時(shí)顯著下降 (P＜0.05)，25 μmol·L-1MT溶液預(yù)處理顯著抑制了干旱脅迫下CAT 活性的下降 (P＜0.05)。復(fù)水 1 d 后，干旱處理后的CAT活性的變化不明顯，而MT處理組的CAT活性比干旱處理組增加了126.17%(圖3)。干旱處理4 d顯著增加了多年生黑麥草的POD活性(P＜ 0.05)。 與 對 照 相 比 ， 11 d 的 干 旱 脅 迫 對POD 活性沒有顯著影響 (P＞0.05)。在 4 d 和 11 d 干旱脅迫下，與未添加MT的干旱處理相比，MT預(yù)處理均顯著增加了葉片中的POD活性(P＜0.05)。復(fù)水 1 d 后 POD 活性顯著增加 (P＜0.05)，與對照相比，干旱脅迫條件下，不添加MT和MT預(yù)處理后，POD活性分別增加56.59%和146.79%(圖3)。

圖 3 褪黑素溶液預(yù)處理對多年生黑麥草超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶活性的影響Figure 3 Effect of 25 μmol·L-1 melatonin pretreatment on the superoxide dismutase, catalase and peroxidase activities of perennial ryegrass (Lolium perenne)

2.4 對多年生黑麥草代謝產(chǎn)物積累的影響

采用 GC-MS 的方法，從干旱脅迫 4 d、11 d 和復(fù)水后1 d的葉片中篩選出100種化合物。其中，有機(jī)酸占30%，氨基酸占24%，糖醇類占30%，其他化合物占16%。采用偏最小二乘判別分析(Partial least squares-discriminate analysis, PLS-DA)的方法分析了MT處理對干旱脅迫條件下多年生黑麥草代謝產(chǎn)物積累的影響，結(jié)果表明，灌溉和干旱處理組可以很好的分離，而隨著處理時(shí)間的延長，CK和MCK兩組之間的差異減少。與灌溉相比，在干旱脅迫條件下，MT對代謝產(chǎn)物積累的影響比較大，尤其是在11 d和復(fù)水1 d的情況下。這與生理指標(biāo)以及抗氧化酶的分析結(jié)果一致(圖4)。

圖 4 褪黑素溶液預(yù)處理對多年生黑麥草干旱脅迫 4 d、11 d和復(fù)水1 d葉片中代謝物總量變化的偏最小二乘判別分析Figure 4 Partial least squares-discriminate analysis of the metabolic profiles of leaves of perennial ryegrass (Lolium perenne) after 4 days (A) and 11 days (B) of drought stress and after 1 day of rewater with 25 μmol·L-1 melatonin pretreatment

根 據(jù) 變 異 權(quán) 重 系 數(shù) (Variable importance in the projection, VIP)，選擇VIP大于1的代謝產(chǎn)物重點(diǎn)關(guān)注。表1、表2和表3分別為干旱脅迫4 d、11 d以及復(fù)水1 d時(shí)葉片中VIP值大于1的代謝產(chǎn)物列

表 1 干旱脅迫4 d多年生黑麥草氣相色譜-質(zhì)譜檢測化合物相對含量Table 1 The relative levels of metabolites identified by gas chromatography-mass spectrometry of perennial ryegrass (Lolium perenne) after 4 days of drought stress

表 2 干旱脅迫11 d多年生黑麥草氣相色譜-質(zhì)譜檢測化合物相對含量Table 2 The relative levels of metabolites identified by gas chromatography-mass spectrometry in perennial ryegrass (Lolium perenne) after 11 days of drought stress

表。在干旱脅迫 4 d、11 d 和復(fù)水 1 d，分別篩選出VIP大于1的代謝產(chǎn)物40種(表1)、36種(表2)和35種(表3)。和灌溉的對照相比，計(jì)算關(guān)鍵化合物相對含量的變化，計(jì)算方法為(處理的相對含量-CK相對含量)/CK相對含量 × 100%。同時(shí)，以相對含量變化幅度大于50%或小于50%，MCK和MD有相同的變化趨勢，篩選MT影響多年生黑麥草抗旱性的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物。在干旱脅迫4 d時(shí)，篩選出8種代謝產(chǎn)物，分別是谷氨酸、葡萄糖胺、脯氨酸、纈氨酸、赤蘚糖醇、異亮氨酸、2-氨基庚二酸和葡萄糖(表1)。在干旱脅迫11 d時(shí)，篩選出4種代謝產(chǎn)物，分別是亮氨酸、奎寧酸、丙氨酸甲酯和天冬酰胺(表2)。在復(fù)水1 d時(shí)，篩選出8種代謝產(chǎn)物，分別是乙二醇、琥珀酸、赤蘚酮糖、糠醇、鳥氨基、異亮氨酸、甘氨酸和尿素(表 3)。

表 3 復(fù)水1 d多年生黑麥草氣相色譜-質(zhì)譜檢測化合物相對含量Table 3 The relative levels contents of metabolites identified by gas chromatography-mass spectrometry in perennial ryegrass(Lolium perenne) after 1 day of rewater after drought stress

3 討論與結(jié)論

3.1 改善抗旱相關(guān)生理指標(biāo)，提高抗氧化酶活性，提高多年生黑麥草的抗旱性

25 μmol·L-1MT 溶液預(yù)處理可以顯著增加干旱脅迫條件下多年生黑麥草的TQ(P＜0.05)，也有利于復(fù)水后TQ的回升，提高干旱脅迫條件下多年生黑麥草的品質(zhì)。Fv/Fm是衡量植物光合效率的重要指標(biāo)，在本研究中觀察到，25 μmol·L-1MT 溶液預(yù)處理顯著提高了干旱脅迫和復(fù)水后多年生黑麥草的Fv/Fm(P＜0.05)，有利于維持葉片正常的光合作用，提高多年生黑麥草對干旱的抗性。葉片RWC是評估植物內(nèi)部水分含量和水分缺失程度的重要指標(biāo)。與Fv/Fm的變化趨勢一致，MT預(yù)處理有利于降低干旱脅迫對葉片RWC的影響。干旱脅迫致使植物細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生MDA，破環(huán)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞液和離子外滲，提高植物組織的相對電導(dǎo)率[18]。在本研究中，在干旱脅迫4 d和11 d，都觀察到干旱處理組EL值和MDA含量的顯著上升(P＜0.05)，但MT預(yù)處理顯著抑制了EL值和MDA含量的上升速率(P＜0.05)。而復(fù)水后，MT處理又有利于細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的修復(fù)。說明，25 μmol·L-1MT 溶液預(yù)處理能夠維持干旱脅迫條件下多年生黑麥草細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。

干旱脅迫會導(dǎo)致植物組織中活性氧的積累，破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，影響細(xì)胞的代謝[19]。而SOD是清除超氧陰離子(O2·-)的特異性酶[20]。干旱脅迫4 d時(shí)，干旱處理組SOD活性的增加可能是一種特異性的誘導(dǎo)反應(yīng)，以清除過量的O2·-。而在 11 d 和復(fù)水1 d時(shí)，干旱處理組SOD的活性顯著下降(P＜0.05)，這可能是由于長期的干旱脅迫導(dǎo)致SOD部分失活，但 25 μmol·L-1MT 預(yù)處理顯著增加了干旱脅迫和復(fù)水后SOD的活性(P＜0.05)。CAT是一種重要的 H2O2清除酶，干旱脅迫 4 d和 11 d，25 μmol·L-1MT 預(yù)處理顯著抑制了 CAT 活性的下降速率 (P＜0.05)。而復(fù)水 1 d，MT 預(yù)處理又顯著促進(jìn)了CAT活性的增加(P＜0.05)。POD可以分解細(xì)胞內(nèi)H2O2、胺類和酚類等有害物質(zhì)。在本研究中，干旱脅迫導(dǎo)致多年生黑麥草POD活性顯著上升(P＜0.05)，而 25 μmol·L-1MT 預(yù)處理顯著增加了干旱脅迫條件下多年生黑麥草POD酶活性的上升幅度 (P＜0.05)。綜上所述，25 μmol·L-1MT 預(yù)處理通過提高干旱脅迫條件下多年生黑麥草SOD、CAT、POD活性，增加細(xì)胞活性氧的清除能力，維持細(xì)胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，提高光化學(xué)效率，延緩葉片的衰老，增強(qiáng)細(xì)胞的保水能力，從而提高多年生黑麥草的抗旱性。

3.2 提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的表達(dá)，提高多年生黑麥草的抗旱性

氨基酸是蛋白質(zhì)的重要組成成分，在植物的代謝過程中具有不可替代的作用，同時(shí)很多氨基酸含量的高低與植物非生物脅迫抗性具有一定的相關(guān)性。在本研究中總計(jì)檢測到24種氨基酸，與MT作用相關(guān)的氨基酸有8種，其中，脯氨酸、異亮氨酸和鳥氨基含量的變化最明顯。與干旱對照相比，25 μmol·L-1MT 預(yù)處理 4 d 提高了脯氨酸的相對含量，而脯氨酸在植物的滲透調(diào)節(jié)、自由基清除和維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定等與植物抗性相關(guān)的功能中具有重要作用[21]，這一結(jié)果也與相關(guān)的生理指標(biāo)相對應(yīng)。異亮氨酸是重要的支鏈氨基酸，干旱條件下，豌豆(Pisum sativum)[22]、小麥(Triticum aestivum)擬南芥(Arabidopsis thaliana)的葉片中都發(fā)現(xiàn)了異亮氨酸的積累。MT處理?xiàng)l件下，異亮氨酸的含量增加，可能和能量代謝有關(guān)[23]。鳥氨酸是脯氨酸生物合成的前體，在復(fù)水1 d，鳥氨酸的積累可能和脯氨酸的代謝有關(guān)(表3)。

受MT影響，含量發(fā)生顯著變化的有機(jī)酸主要是奎寧酸和2-氨基庚二酸。奎寧酸是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，已有的研究表明，西班牙栓皮櫟(Quercus suber)自然干旱[24]和北美黑楊(Populus deltoides)人為干旱條件下[25]，奎寧酸的含量顯著增加?？鼘幩釁⑴c苯丙氨酸代謝[26]。在本研究中，MT預(yù)處理?xiàng)l件下，奎寧酸積累可能和苯丙氨酸的高表達(dá)有關(guān)(結(jié)果未顯示)。干旱脅迫下，Carmo-Silva等在狗牙根和結(jié)縷草(Zoysia japonica)的葉片中也發(fā)現(xiàn)了2-氨基庚二酸[27]，而關(guān)于2-氨基庚二酸的生理功能以及與MT處理的關(guān)系，未見報(bào)道。

干旱脅迫影響糖和糖醇的表達(dá)。在本研究中，MT預(yù)處理后，含量變化最顯著的是赤蘚酮糖。在對照以及干旱脅迫條件下，MT預(yù)處理都增加了赤蘚酮糖的含量。赤蘚酮糖是糖酵解的中間產(chǎn)物，赤蘚糖醇是赤蘚酮糖的前體。赤蘚酮糖也是維生素C的降解產(chǎn)物之一[28]，而在MT影響下，赤蘚酮糖積累的原因還有待進(jìn)一步分析。MT預(yù)處理顯著增加了灌溉和干旱條件下尿素和葡萄糖胺的含量。Shi等[4]也發(fā)現(xiàn)了干旱脅迫前用MT預(yù)處理顯著增加尿素的含量。尿素的積累可能主要是用于多胺類物質(zhì)的合成。Naeem等[29]發(fā)現(xiàn)了干旱脅迫條件下，鷹嘴豆(Cicer arietinum)葉片中的葡萄糖胺下降。而關(guān)于MT預(yù)處理影響葡萄糖胺積累的生理機(jī)制，還有待進(jìn)一步分析。

綜上所述，25 μmol·L-1褪黑素預(yù)處理可能主要通過提高干旱脅迫條件下多年生黑麥草異亮氨酸、脯氨酸、鳥氨基、奎寧酸、2-氨基庚二酸、赤蘚酮糖、尿素和葡萄糖胺等相關(guān)代謝產(chǎn)物的積累，增強(qiáng)多年生黑麥草的滲透調(diào)節(jié)能力和抗氧化能力等，進(jìn)而提高多年生黑麥草的抗旱性。