組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300/CBP抑制劑的研究進(jìn)展

吳軍，王亞洲，楊圣偉，李志裕*

（1.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 211198；2.南京圣和藥業(yè)研發(fā)中心，江蘇 南京 210018）

組蛋白的乙?；腿ヒ阴；且环N可逆的翻譯后修飾（post-translational modification，PTM），在真核細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控中起關(guān)鍵作用[1]，是表觀遺傳學(xué)的重點(diǎn)研究內(nèi)容。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferase，HAT）和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）可以影響組蛋白的乙?；琀AT和HDAC的募集和正常功能的發(fā)揮是基因表達(dá)和細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)控步驟，這些酶的功能性缺陷可能導(dǎo)致包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病[2]。截至目前，已有多個(gè)HDAC抑制劑上市，如羅米地辛（romidepsin）、貝利司他（belinostat）等。隨著研究的不斷深入，有關(guān)HAT抑制劑的報(bào)道也越來越多。由高度同源的HAT腺病毒E1A相關(guān)的300 kDa蛋白（adenoviral E1A binding protein of 300 kDa，p300）和環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白的結(jié)合蛋白（CREB binding protein，CBP）組成的p300/CBP家族是HAT家族的主要成員之一。p300/CBP參與細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞的生長、分化和發(fā)展，是一類非常重要的輔激活因子[3]。研究表明：p300/CBP在多種不同的腫瘤中高度表達(dá)和激活，因此p300/CBP及其抑制劑越來越受到研究者的關(guān)注。本文對(duì)p300/CBP抑制劑的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為開發(fā)新型選擇性p300/CBP抑制劑提供參考。

1 p300與CBP的結(jié)構(gòu)與生化功能

p300/CBP家族是哺乳動(dòng)物4個(gè)主要的HAT多基因家族之一[4]。CBP由2 441個(gè)氨基酸組成，p300由2 414個(gè)氨基酸組成，這2種蛋白質(zhì)具有約75%的序列相似性和63%的同一性[5-6]。

p300/CBP蛋白分為結(jié)構(gòu)化與非結(jié)構(gòu)化的區(qū)域，其中非結(jié)構(gòu)化區(qū)域約占整體的50%以上，結(jié)構(gòu)化區(qū)域包括：轉(zhuǎn)錄適配器鋅指結(jié)構(gòu)域1（transcriptional adapter zinc finger domain 1，TAZ1）、激酶誘導(dǎo)的CREB相互作用結(jié)構(gòu)域（kinase inducible domain of CREB interacting domain，KIX）、溴域（bromodomain，BRD）、植物同源結(jié)構(gòu)域（plant homeodomain，PHD）、HAT結(jié)構(gòu)域、ZZ型鋅指結(jié)構(gòu)域（ZZ-type zinc finger domain，ZZ）和轉(zhuǎn)錄適配器鋅指結(jié)構(gòu)域2（transcriptional adapter zinc finger domain 2，TAZ2）（見圖1）[7]。大多數(shù)已知的p300/CBP功能結(jié)構(gòu)域位于高度保守的反式激活區(qū)域（transactivation domain，TAD），p300/CBP通過TAD與許多DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子以及一般轉(zhuǎn)錄因子相互作用，從而介導(dǎo)基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄機(jī)制向啟動(dòng)子的募集以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄[6]。

圖1 CBP和p300的結(jié)構(gòu)域示意圖Figure 1 A schematic representation of the domain structure of CBP and p300

p300/CBP包含一個(gè)HAT，通過乙酰化組蛋白重塑染色質(zhì)以改變其結(jié)構(gòu)，影響基因的轉(zhuǎn)錄[8]。p300/CBP的HAT活性也會(huì)使一些轉(zhuǎn)錄因子（如p53）乙?；?，從而調(diào)節(jié)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的功能[3]。

p300/CBP的BRD結(jié)構(gòu)域由110個(gè)氨基酸殘基組成，其特征性結(jié)構(gòu)由螺旋環(huán)連接的4個(gè)α螺旋（αZ、αA、αB、αC）組成，稱為BRD折疊。p300/CBP BRD結(jié)構(gòu)域的LPF shelf區(qū)不同于溴域和額外終端域家族蛋白（bromodomain and extra terminal domain family，BET）BRD結(jié)構(gòu)域的WPF shelf區(qū)，雖然苯丙氨酸幾乎是不變的，但其他2個(gè)氨基酸殘基在大小、疏水性和對(duì)主鏈構(gòu)象性質(zhì)的影響上均是不同的，因此LPF shelf區(qū)以及ZA channel區(qū)是增強(qiáng)BRD結(jié)構(gòu)域抑制劑親和力和選擇性的關(guān)鍵區(qū)域[9]。另外，具有BRD結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)能夠讀取與表觀遺傳信息傳遞相關(guān)的乙酰賴氨酸標(biāo)記，以讀取者的角色在表觀遺傳調(diào)控中發(fā)揮作用，最終決定PTM對(duì)蛋白質(zhì)功能的調(diào)節(jié)。

2 p300/CBP與惡性腫瘤的關(guān)系

多項(xiàng)研究表明：p300和CBP是癌癥進(jìn)展的積極調(diào)節(jié)因子，與各種人類腫瘤疾病密切相關(guān)[10-12]。在結(jié)腸癌、人小細(xì)胞肺癌以及非小細(xì)胞肺癌中p300/CBP的表達(dá)水平上調(diào)，是患者預(yù)后不良的指標(biāo)[13-15]。在乳腺癌中高表達(dá)的p300可能促進(jìn)腫瘤的復(fù)發(fā)，與乳腺癌的侵襲性特征相關(guān)[16]。在肝細(xì)胞癌中，p300的高表達(dá)與血管浸潤增強(qiáng)、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和閾值縮短有關(guān)[17]。在前列腺癌中，雄激素誘導(dǎo)的雄激素受體（androgen receptor，AR）向染色質(zhì)募集與H3K27乙?；芮邢嚓P(guān)，通過阻止H3K27乙?；宰柚筽300/CBP在AR上的共激活因子功能的發(fā)揮，從而阻斷關(guān)鍵增殖基因的表達(dá)和腫瘤的生長，顯示了p300/CBP抑制劑在前列腺癌治療領(lǐng)域的潛力[18]。

多項(xiàng)研究表明：突變的p300/CBP與許多血液惡性腫瘤相關(guān)[19-21]。在小鼠模型中使用體外和體內(nèi)的基因敲除等實(shí)驗(yàn)證明了表觀遺傳調(diào)控因子p300/CBP在誘導(dǎo)和維持急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）中的作用，使用p300/CBP小分子抑制劑誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡，在多種AML亞型中具有療效[22]。急性淋巴細(xì)胞白血病（acute lymphoblastic leukaemia，ALL）是最常見的兒童期惡性腫瘤，有研究表明p300/CBP參與了復(fù)發(fā)性ALL相關(guān)染色體易位，是腫瘤細(xì)胞生長的關(guān)鍵調(diào)控因子[23]。

3 p300/CBP抑制劑

p300/CBP是腫瘤疾病的重要靶標(biāo)之一，研究人員長期致力于設(shè)計(jì)和發(fā)現(xiàn)靶向p300/CBP的優(yōu)質(zhì)小分子抑制劑。根據(jù)作用位點(diǎn)的不同，本文將從p300/CBP的BRD結(jié)構(gòu)域、HAT結(jié)構(gòu)域這2個(gè)方面闡述，重點(diǎn)介紹目前最有效、最具選擇性的小分子p300/CBP 抑制劑的研究進(jìn)展。

3.1 作用于p300/CBP BRD結(jié)構(gòu)域的抑制劑

Zhou的團(tuán)隊(duì)和Hewings的團(tuán)隊(duì)開展了抑制CBP BRD結(jié)構(gòu)域的開創(chuàng)性工作，親和力達(dá)微摩爾級(jí)別的代表性化合物有MS7972（1，CBP：Kd= 19.6 μmol . L-1）[24]、ischemin（2，CBP：Kd= 19 μmol . L-1）[25]和化合物 3（CBP：IC50= 28.1 μmol . L-1）[26]，Rooney 等[27]在化合物 4（CBP：IC50= 29.4 μmol . L-1）的基礎(chǔ)上，將母核改為喹喔啉酮以防止芐基氧化，同時(shí)在5位引入帶有四氫喹啉的側(cè)鏈得到了化合物5（CBP：IC50= 323 nmol · L-1），其四氫喹啉環(huán)能與BRD結(jié)構(gòu)域的LPF shelf特異性相互作用，使化合物5成為全球首個(gè)披露的親和力達(dá)亞微摩爾級(jí)別的CBP抑制劑。Xu等[28]和Unzue等[29]通過虛擬篩選得到化合物6（CBP：Kd= 5 μmol . L-1），再用苯甲酸取代化合物6的富馬酸側(cè)鏈，進(jìn)一步優(yōu)化得到了10倍以上效力的化合物7（CBP：IC50= 170 nmol . L-1），以及化合物 8（CBP：IC50=400 nmol . L-1）。其中化合物7對(duì)CBP的抑制作用是BET蛋白家族BRD4第一溴域[the first bromodomain of BRD4，BRD4(1)]的60倍。

牛津大學(xué)結(jié)構(gòu)基因組學(xué)協(xié)會(huì)（Structural Genomics Consortium，SGC）的研究人員首先設(shè)計(jì)并合成了苯并咪唑類化合物9[30]，但9對(duì)CBP和BRD4的選擇性不高（CBP：IC50= 4 μmol · L-1，BRD4：IC50= 6.3 μmol · L-1），通過對(duì)其N1和C2位置的取代修飾，提高對(duì)BRD結(jié)構(gòu)域中LPF shelf以及ZA channel的選擇性作用，經(jīng)過進(jìn)一步優(yōu)化得到了化合物 10（CBP：IC50= 0.12 μmol · L-1，BRD4：IC50= 2.4 μmol · L-1）與 11（SGC-CBP30，CBP：IC50= 69 nmol . L-1、Kd= 21 nmol . L-1，p300：Kd= 32 nmol . L-1）[5]，其中化合物11具有較強(qiáng)的親和力，對(duì)CBP的抑制作用是BRD4(1)的40倍、BRD4(2)的250倍。

輝瑞（Pfizer）公司的Denny等[31]以化合物10為起點(diǎn)旨在設(shè)計(jì)出一類選擇性達(dá)到100倍的化合物，通過對(duì)其C2側(cè)鏈中苯環(huán)上取代基的修飾，增強(qiáng)與BRD結(jié)構(gòu)域中的精氨酸1173的陽離子π相互作用得到了 化 合 物 12（PF-CBP1，CBP：IC50= 130 nmol · L-1，BRD4：IC50= 18 μmol · L-1）。 對(duì) 化 合 物 10 與 BRD4復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)（見圖2）的研究發(fā)現(xiàn)，苯并咪唑的3位N與脯氨酸82通過水分子氫鍵產(chǎn)生相互作用，將母核改為吲哚以阻斷氫鍵相互作用，則大大減弱了對(duì)BRD4的親和力，進(jìn)一步增大N3區(qū)域的極性得到了以氮雜吲哚為母核的化合物13（PF-CBP2，CBP：IC50=170 nmol · L-1，BRD4：IC50= 18.4 μmol · L-1），該化合物對(duì)CBP的抑制作用是BRD4的108倍，同時(shí)還具有良好的細(xì)胞滲透性等。

圖2 化合物10與BRD4的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)（PDB 5CFW）Figure 2 Crystal structure of compound 10 in complex with BRD4 (PDB 5CFW)

SGC的研究人員設(shè)計(jì)并發(fā)現(xiàn)的另一類p300/CBP BRD結(jié)構(gòu)域抑制劑以化合物14為基本骨架，首先優(yōu)化得到了化合物15（I-CBP112，CBP：IC50= 170 nmol · L-1）[23]，其對(duì) CBP 的親和力是 BRD4(1)[CBP：Kd= 151 nmol · L-1，BRD4(1)：Kd= 5.6 μmol · L-1]的 37 倍?；衔?15 可導(dǎo)致細(xì)胞集落形成明顯受損，并誘導(dǎo)細(xì)胞分化，此外該化合物具有在體外和體內(nèi)以劑量依賴性方式顯著降低MLLAF9+AML細(xì)胞發(fā)病的潛力。在化合物15的C9位置引入堿性酰胺基團(tuán)，得到了化合物16[TPOP146[32]，CBP：Kd= 134 nmol · L-1，BRD4(1)：Kd= 5.02 μmol · L-1]， 其 對(duì)CBP的親和力是BRD4(1)的37倍，并能夠抑制CBP向細(xì)胞染色質(zhì)的募集。

Cellcentric公司也就p300/CBP BRD結(jié)構(gòu)域抑制劑發(fā)表了4篇專利[33-36]，其主推的藥物CCS1477（CBP：Kd= 1.7 nmol · L-1，p300：Kd= 1.3 nmol · L-1） 是 一 種 有效的、高選擇性的、口服活性的小分子抑制劑，其具體結(jié)構(gòu)并未披露，專利結(jié)構(gòu)通式（17 ～ 20）以及實(shí)施例中所披露的化合物與SGC類似，均為（氮雜）苯并咪唑類結(jié)構(gòu)。CCS1477對(duì)AR驅(qū)動(dòng)的前列腺癌VCaP細(xì)胞系的 IC50為 49 nmol · L-1，對(duì) p300/CBP 的親和力是BRD4的170倍，主要用于治療轉(zhuǎn)移性去勢(shì)抵抗性前列腺癌（metastatic castration-resistant prostate cancer，mCRPC），對(duì)AML、肺癌、膀胱癌等也有治療潛力，已于2018年7月開展用于治療mCRPC和晚期實(shí)體腫瘤的Ⅰ期臨床試驗(yàn)。

基因泰克（Genentech）公司以基于片段的方法篩選出苯并二氮雜?類的化合物 21（ CBP：Kd= 32 μmol · L-1）[37]，以該化合物為先導(dǎo)化合物，通過進(jìn)一步優(yōu)化得到的化合 物 22（CPI-637，CBP：IC50= 30 nmol · L-1，BRD4：IC50= 11 μmol · L-1）對(duì) CBP 的抑制作用 是 BRD4(1)的367倍，并具有優(yōu)良的生物化學(xué)活性（MYC：EC50= 0.6 μmol · L-1），但化合物22以及對(duì)其進(jìn)一步修飾得到的化合物不能滿足作為體內(nèi)探針的要求。

為了開發(fā)出一系列具有體內(nèi)活性的化合物，基因泰克公司通過配體高效篩選得到的先導(dǎo)化合物23（CBP：IC50= 620 nmol · L-1）[38]對(duì) p300/CBP 的親和力是BRD4(1)的100倍。對(duì)化合物23與CBP BRD結(jié)構(gòu)域的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的研究顯示，在N1位置引入四氫呋喃環(huán)增強(qiáng)與ZA Loop的相互作用，在苯環(huán)對(duì)位引入甲基吡唑增強(qiáng)與LPF區(qū)域的范德華作用力，在苯環(huán)鄰位引入氟原子則改善了小鼠肝細(xì)胞穩(wěn)定性，經(jīng)過這一系列的優(yōu)化最終得到了化合物24（GNE-272，CBP：IC50=20 nmol · L-1，p300：IC50= 30 nmol · L-1），該化合物對(duì)CBP的抑制作用是BRD4(1)的650倍并同時(shí)具有良好的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)特性，在白血病癌細(xì)胞系MV4-11中具有明顯的抑制MYC表達(dá)作用（EC50= 0.91 μmol · L-1），在體內(nèi)能夠調(diào)節(jié)CBP依賴性MYC轉(zhuǎn)錄，并與MYC依賴性AML腫瘤模型中的抗腫瘤活性相對(duì)應(yīng)。通過分析化合物24與CBP以及BRD4（1）作用方式的不同之處發(fā)現(xiàn)，將化合物24的苯胺限制為四氫喹啉環(huán)，選擇性提高了2倍，將N1位的四氫呋喃環(huán)更換為四氫吡喃環(huán)可以增強(qiáng)其生化與細(xì)胞活力，進(jìn)一步優(yōu)化以減小中樞神經(jīng)副作用得到了化合物25（GNE-781，CBP：IC50=0.94 nmol · L-1，p300：IC50= 1.2 nmol · L-1）[39]， 該 化 合物對(duì)CBP的抑制作用是BRD4（1）的5 425倍，化合物25是非中樞神經(jīng)系統(tǒng)滲透劑，但其較低的分布容積（Vss=0.6 L · kg-1）、較短的半衰期（T1/2= 1.4 h）限制了其進(jìn)一步的發(fā)展，為了延長該化合物的半衰期，開發(fā)出一類含有異喹啉結(jié)構(gòu)的p300/CBP抑制劑26（GNE-207，CBP：IC50= 1 nmol · L-1）[40]，該化合物的分布容積（Vss= 2.8 L · kg-1）、半衰期（T1/2= 2 h）與化合物25相比均有所改善，對(duì)CBP的抑制作用是BRD4的3 100倍。

3.2 作用于p300/CBP HAT結(jié)構(gòu)域的抑制劑

早期文獻(xiàn)報(bào)道的p300/CBP HAT結(jié)構(gòu)域小分子抑制劑有化合物 27（Lys-CoA，p300：IC50≈ 0.5 μmol . L-1）[41]、28（anacardic acid，p300：IC50≈ 8.5 μmol . L-1）[42]、29（curcumin，p300：IC50= 25 μmol . L-1）[43]。 天 然 產(chǎn) 物30（garcinol，p300：IC50≈ 7 μmol . L-1）[2]是來源于藤黃果皮的聚異戊二烯化二苯甲酮衍生物，其可在體外和體內(nèi)有效地抑制p300和p300/CBP相關(guān)因子（p300/CBP-associated factor，PCAF）的HAT活性，抑制依賴HAT活性的染色質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，但細(xì)胞毒性較大。以化合物30的異構(gòu)體isogarcinol為起點(diǎn)合成了一系列相關(guān)化合物，其中化合物 31（LTK-14，p300：IC50≈ 6 μmol . L-1）[44-45]是組蛋白和乙酰輔酶A非競(jìng)爭性抑制劑，能夠特異性抑制p300介導(dǎo)的p53的乙?；?。在T細(xì)胞中，化合物31通過抑制組蛋白乙?；种迫祟惷庖呷毕莶《荆╤uman immunodeficiency virus，HIV）的增殖。

早期發(fā)現(xiàn)的p300/CBP HAT結(jié)構(gòu)域抑制劑僅顯示適度的抑制效力和選擇性，并且具有較差的細(xì)胞滲透性。Bowers等[46]和 Shrimp等[47]通過虛擬篩選得到了吡唑啉酮類小分子化合物32（C646，p300：IC50=6.8 μmol . L-1），該化合物為 10 μmol · L-1時(shí)可以高選擇性地抑制p300（抑制率為86%），且對(duì)組蛋白乙?；?、體外微管蛋白聚合和細(xì)胞生長的抑制實(shí)驗(yàn)證實(shí)了化合物32作為一種藥理學(xué)探針的效用，被廣泛用于研究抑制p300/CBP HAT結(jié)構(gòu)域的工具化合物。但作為包含親電基團(tuán)的抑制劑，由于被大量蛋白質(zhì)和代謝物硫醇沉淀消耗而導(dǎo)致化合物32細(xì)胞抑制活性的降低。艾伯維（AbbVie）公司的研究人員以分子對(duì)接命中的乙內(nèi)酰脲類化合物33（p300：IC50= 5.1 μmol . L-1）為先導(dǎo)化合物，設(shè)計(jì)了一類具有螺茚滿乙內(nèi)酰脲結(jié)構(gòu)的化合物，后在母核5位引入脲取代基提高了肝微粒體穩(wěn)定性，經(jīng)過進(jìn)一步的優(yōu)化最終得到了化合物34（A-485，p300：IC50= 60 nmol · L-1）[48-49]，一個(gè)親和力達(dá)納摩爾級(jí)別、高選擇性的、類藥性的、可口服的p300/CBP HAT小分子抑制劑。進(jìn)一步的研究分析化合物34對(duì)124種不同癌癥細(xì)胞系增殖的影響發(fā)現(xiàn)，其在套細(xì)胞淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞以及AR陽性的前列腺癌細(xì)胞中具有顯著的抑制活性。使用AR陽性的CRPC模型（LuCaP-77 CR）來評(píng)估化合物34抑制體內(nèi)腫瘤生長的實(shí)驗(yàn)表明，在嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency，SCID）雄性小鼠中建立腫瘤模型，每日2次腹腔注射給藥21 d后，化合物34對(duì)腫瘤生長抑制率達(dá)54%。此外，對(duì)荷瘤小鼠連續(xù)7 d給藥，可導(dǎo)致在mRNA水平MYC的下降。化合物34具有優(yōu)異的細(xì)胞和藥動(dòng)學(xué)特性，可以在體外和體內(nèi)條件下用于研究抑制p300/CBP HAT結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)作用。

4 結(jié)語

經(jīng)過多年的研究探索，人們對(duì)p300/CBP的結(jié)構(gòu)和功能有了更深刻的認(rèn)識(shí)，p300/CBP通過自身的HAT活性以及BRD調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，參與細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞的生長、分化和發(fā)展，并與多種腫瘤疾病、神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)。多個(gè)高校、研究所以及藥企的研究團(tuán)隊(duì)開展了設(shè)計(jì)發(fā)現(xiàn)靶向p300/CBP的BRD結(jié)構(gòu)域或HAT結(jié)構(gòu)域小分子抑制劑的工作，值得關(guān)注的是無論是靶向p300/CBP BRD還是HAT結(jié)構(gòu)域，均要考慮對(duì)其他HAT或擁有BRD的蛋白家族的選擇性問題。經(jīng)過持續(xù)的努力，最終發(fā)現(xiàn)多個(gè)親和力達(dá)納摩爾級(jí)別、高選擇性的p300/CBP小分子抑制劑。但如何將其優(yōu)異的酶抑制活性轉(zhuǎn)化為細(xì)胞抑制活性和相應(yīng)腫瘤模型上的抑制效力亟待解決，現(xiàn)僅有作用于p300/CBP BRD結(jié)構(gòu)域的小分子抑制劑CCS1477進(jìn)入Ⅰ期臨床，用于治療mCRPC和晚期實(shí)體腫瘤。未來利用選擇性小分子抑制劑繼續(xù)探索論證p300/CBP的生物學(xué)功能，以及更多可成藥的抑制劑完成臨床前研究進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)，通過臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果將驗(yàn)證p300/CBP作為腫瘤疾病治療靶標(biāo)的有效性和可行性。