云芝菌絲深層發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

周春元 樸向民 閆梅霞 崔麗麗 王英平

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林長春130112）

云芝（Coriolus versicolor）隸屬于多孔菌科、栓屬的一種珍貴的藥食同源真菌，又名雜色云芝、彩云革蓋菌、千層蘑等，多為野生[1]。云芝含有豐富的多糖、蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、紫色素、萜類等多種生物活性物質(zhì)，具有清熱、解毒、消炎、抗癌、保肝等功效[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，云芝多糖是云芝中的主要生物活性成分[3]，其子實(shí)體和菌絲體中均含有多糖[4-5]。

季宏更等[6]、李宇偉等[7]、丁湖廣[8]、周選圍等[9]對(duì)云芝的高產(chǎn)栽培技術(shù)進(jìn)行了研究。近年來，隨著人們對(duì)云芝藥用價(jià)值研究的深入，許多藥品行業(yè)對(duì)其需求也越來越大，但由于人工栽培云芝生產(chǎn)周期長，產(chǎn)量低，導(dǎo)致供應(yīng)不上生產(chǎn)的需求。為此，研究云芝菌絲深層發(fā)酵技術(shù)非常重要。筆者以云芝菌絲生物量為研究指標(biāo)，通過深層發(fā)酵進(jìn)行研究，以期在短時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)大量菌絲體，為今后云芝多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌種

云芝菌種來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所菌種保藏室，菌株編號(hào)（TC001）。

1.1.2 儀器

HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱市東聯(lián)生化儀器有限公司，PL4002精密電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司，BMJ霉菌培養(yǎng)箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，SW-CJ-IFD潔凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠，GZX-9146 MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

葡萄糖2%，酵母粉1%，MgSO40.1%，KH2PO40.2%，自然pH，121℃滅菌30 min[10]。

1.2.2 培養(yǎng)方法

按基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方，分別選用不同的碳源（蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、麥芽糖）、氮源（牛肉膏、蛋白胨、尿素、硝酸銨），進(jìn)行碳、氮源比較試驗(yàn)；以菌絲干重作為選擇標(biāo)準(zhǔn)，篩選出適合云芝深層發(fā)酵培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基。以上試驗(yàn)均采用250 mL的三角瓶裝內(nèi)裝入100 mL培養(yǎng)基置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱（轉(zhuǎn)速150 r/min）中培養(yǎng)7 d。重復(fù)3次。

1.2.3 生物量的測(cè)定

用4層紗布過濾發(fā)酵液，菌絲體經(jīng)蒸餾水沖洗3次后，在50℃的條件下烘干至恒重，電子天平稱菌絲體干重[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源種類篩選

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入5種不同碳源，取代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖進(jìn)行碳源試驗(yàn)。從圖1可以看出，云芝菌絲深層發(fā)酵以蔗糖作為碳源效果最好，其次是葡萄糖和可溶性淀粉，而乳糖對(duì)菌絲生長的影響最小。

2.2 氮源種類篩選

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入5種不同氮源，取代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的酵母粉進(jìn)行氮源試驗(yàn)。從圖2可以看出，云芝菌絲深層發(fā)酵以牛肉膏作為氮源效果最好，其次是蛋白胨，而尿素對(duì)菌絲生長的影響最小。

圖1 不同碳源對(duì)菌絲生長的影響

2.3 正交試驗(yàn)因素水平

在上述單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以蔗糖為碳源，牛肉膏為氮源，MgSO4和KH2PO4為無機(jī)鹽，設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)L9（34），各因素水平及正交試驗(yàn)結(jié)果見表1、表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

2.4 正交試驗(yàn)條件

以蔗糖為碳源，牛肉膏為氮源，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，蔗糖的級(jí)差最大，其次是牛肉膏的級(jí)差最小，各因素對(duì)菌絲產(chǎn)量影響的主次順序?yàn)椋赫崽牵九Ｈ飧啵綤H2PO4＞MgSO4。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析

為了進(jìn)一步明確各因素對(duì)菌絲產(chǎn)量的影響，進(jìn)行了方差分析（表3）。從方差分析看，蔗糖、牛肉膏、KH2PO4和MgSO4在99%的置信度下對(duì)指標(biāo)的影響均極顯著，MgSO4在95%的置信度下對(duì)指標(biāo)的影響顯著，此結(jié)果與級(jí)差的直觀分析一致。因此，四種因素最佳組合為：蔗糖2%，牛肉膏0.3%，KH2PO40.3%，MgSO40.05%。

圖2 不同氮源對(duì)菌絲生長的影響

表3 正交試驗(yàn)的方差分析

3 小結(jié)與討論

以云芝菌絲生物量為研究指標(biāo)，通過單因子試驗(yàn)結(jié)果表明，云芝菌絲深層發(fā)酵適宜的碳源為葡萄糖，適宜的氮源為牛肉膏。在碳源、氮源篩選的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)得出最佳的培養(yǎng)基配方為：蔗糖2%，牛肉膏0.3%，KH2PO40.3%，MgSO40.05%。

關(guān)于云芝菌絲液體培養(yǎng)基優(yōu)化，況明燕等[12]研究表明：云芝菌絲液體發(fā)酵適宜條件為2%乳糖，0.3%酵母浸膏，pH4.5，培養(yǎng)時(shí)間6 d，菌絲量最高為3.950 g/L；曾化偉等[13]研究表明：最優(yōu)培養(yǎng)基配方為黃豆餅粉20 g/L，葡萄糖30 g/L，玉米粉10 g/L，酵母膏5 g/L，CaCO31.5 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO41.5 g/L，pH自然，菌體干質(zhì)量為21.00 g/L；于清偉等[14]研究結(jié)果表明：最適pH為6，最適溫度為25～30℃，最適裝液量為150 mL。本研究結(jié)果與前人研究有所不同，可能與云芝菌株不同產(chǎn)地有關(guān)。