灰樹花液體培養(yǎng)特性及胞外酶活性研究

李文德 張文斌* 華 軍 王治江

（1甘肅省張掖市經(jīng)濟作物推廣站，甘肅張掖7340001；2河西學院農(nóng)業(yè)與生物技術學院，甘肅張掖734000）

灰樹花（Grifola frondosa）又名栗子菇，蓮花菌，舞茸等。隸屬擔子菌門，（Basidiomycota）傘菌亞門，（Agaricomycotina）傘菌綱，（Agaricomycetes）多孔菌目（Polyporales）薄孔菌科（Meripilaceae）樹花菌屬（Grifola），是一種食藥兩用的珍稀食用菌，具有極高的營養(yǎng)價值和藥用價值，此外還具有抗輻射功效[1-2]。香港大學張樹庭教授對其評價是“無葉無芽無花自身結果，可食可補可藥周身是寶”。據(jù)浙江醫(yī)科大學的黃幸紓教授等人的研究及臨床試驗證實，從灰樹花的子實體、菌絲體及發(fā)酵濾液中提取的活性多糖均具有顯著地抗癌及免疫調節(jié)作用[3]。目前國內已展開了灰樹花栽培技術、生態(tài)特性與營養(yǎng)分析等多方面的研究[4-7]，但有關灰樹花液體培養(yǎng)條件和胞外酶活性的研究卻報道不多。筆者研究了灰樹花在不同培養(yǎng)條件下的生長特性及4種胞外酶的活性變化，對加速灰樹花的制種速度，提高灰樹花產(chǎn)量，促進農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥工業(yè)的發(fā)展都具有一定的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

灰樹花2號，購自北京吉蕈園科技有限公司。供試碳源為可溶性淀粉、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、甘露醇，均為分析純。供試氮源為蛋白胨、酵母膏、硝酸鉀、硝酸銨、尿素，均為分析純。麩皮購于張掖市市場。礦質元素為硫酸銅、硫酸亞鐵、磷酸二氫鉀、硫酸錳、硫酸鎂、硫酸鋅，均為分析純。

1.2 供試培養(yǎng)基

母種培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，瓊脂20 g，磷酸二氫鉀0.5 g，硫酸鎂0.5 g，加水1000 mL。液體種培養(yǎng)基為不加瓊脂的母種培養(yǎng)基。碳源基礎培養(yǎng)基為母種培養(yǎng)基中葡萄糖用供試碳源代替。氮源基礎培養(yǎng)基為母種培養(yǎng)基中蛋白胨用供試氮源代替。礦質元素基礎培養(yǎng)基為母種培養(yǎng)基中磷酸二氫鉀、硫酸鎂用供試礦質元素代替。初始pH基礎培養(yǎng)基為母種培養(yǎng)基，用10%的鹽酸和10%氫氧化鈉調至所需pH。

1.3 試驗方法

1.3.1 液體菌種培養(yǎng)

將配制好的液體培養(yǎng)基分裝于三個250 mL三角瓶中，每瓶100 mL，121℃下滅菌30 min，冷卻后接入已經(jīng)活化的斜面母種（0.5 cm×0.5 cm）5片，在25℃、110 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)7 d。

1.3.2 不同碳源對灰樹花菌絲生長的影響

稱取葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露糖、可溶性淀粉各20 g，分別加入1000 mL供試碳源基礎培養(yǎng)基中，每一碳源處理培養(yǎng)液分裝于三個250 mL的三角瓶中，每瓶裝液量100 mL，經(jīng)滅菌后接入5%的液體菌種，在25℃、110 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)。7 d之后測定菌絲生物量。

1.3.3 不同氮源對灰樹花菌絲生長的影響

稱取蛋白胨、酵母膏、尿素、硝酸銨、硝酸鉀、麩皮各4 g，分別溶于1000 mL供試氮源基礎培養(yǎng)基中，每一種氮源處理培養(yǎng)液分裝于三個250 mL的三角瓶中，每瓶裝液量100 mL，接種、培養(yǎng)與測定同1.3.2。

1.3.4 不同礦質元素對灰樹花菌絲生長的影響

稱取硫酸錳、硫酸鎂、硫酸鋅、硫酸亞鐵、硫酸銅、磷酸二氫鉀各0.5 g，分別溶于1000 mL礦質元素基礎培養(yǎng)基中，分裝于250 mL的三角瓶中，每瓶裝液量100 mL，接種、培養(yǎng)與測定同1.3.2。

1.3.5 初始pH對灰樹花菌絲生長的影響

用10%的氫氧化鈉和10%的鹽酸及酸度計調基礎培養(yǎng)基初始pH分別為2、4、6、8、10、12后分裝于250 mL的三角瓶中，每瓶裝液量100 mL。每一處理三個重復，接種、培養(yǎng)與測定同1.3.2。

1.3.6 酶活性測定

粗酶液的制備：在250 mL的三角瓶中加入100 mL液體培養(yǎng)基并在每瓶中接入2%的液體菌種，在25℃、110 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)結束后將菌液用四層紗布過濾，取濾液于10 mL離心管中，在5℃、4000 r/min條件下離心10 min，所得上清液即為粗酶液。

淀粉酶活力的測定參照朱啟忠的方法［8］，羧甲基纖維素酶活力測定、鄰苯二酚氧化酶活性的測定參照馬桂珍的方法［9］，愈創(chuàng)木酚氧化酶活性的測定參照吳進菊的方法［10］。

2 結果與分析

2.1 不同碳源對灰樹花菌絲生長的影響

由表1可知，不同碳源對灰樹花菌絲生長均有影響，六種碳源培養(yǎng)基中葡萄糖為碳源的菌絲生長速度最快，菌絲干重為1.647 g/L，與乳糖、麥芽糖、甘露糖為碳源沒有差異，但與可溶性淀粉、蔗糖為碳源時差異達到顯著水平。蔗糖為碳源的培養(yǎng)基中菌絲生長速度最慢，菌絲干重僅0.941 g/L，與葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基差異顯著，與其他碳源培養(yǎng)基沒有差異。

表1 不同碳源對灰樹花菌絲生長的影響

2.2 不同氮源對灰樹花菌絲生長的影響

由表2可知，不同氮源對灰樹花生長速度均有影響，在硝酸銨作為氮源的培養(yǎng)基中菌絲生長速度最快，菌絲干重為7.877 g/L，與其他氮源差異均達到顯著水平。在尿素為氮源的培養(yǎng)基中菌絲生長速度最慢，菌絲干重為1.064 g/L，與硝酸銨為氮源的培養(yǎng)基差異達到極顯著水平，與其他氮源培養(yǎng)基沒有差異。

表2 不同氮源對灰樹花菌絲生長的影響

2.3 不同礦質元素對灰樹花菌絲生長的影響

由表3可知，不同礦質元素對灰樹花生長均有影響。六種不同的礦質元素培養(yǎng)基中，以磷酸二氫鉀培養(yǎng)基中菌絲生長速度最快，菌絲干重為0.672 g/L，與硫酸亞鐵培養(yǎng)基差異達到顯著水平，與硫酸錳培養(yǎng)基、硫酸銅培養(yǎng)基、硫酸鋅培養(yǎng)基、硫酸鎂培養(yǎng)基達到了極顯著差異水平。六種礦質元素培養(yǎng)基中硫酸鎂培養(yǎng)基菌絲生長最慢的，菌絲干重為0.421 g/L，與磷酸二氫鉀培養(yǎng)基、硫酸亞鐵培養(yǎng)基達到極顯著水平，與硫酸錳培養(yǎng)基達到顯著水平，與其他兩種沒有差異。

表3 不同礦質元素對灰樹花菌絲生長的影響

2.4 不同初始pH對灰樹花菌絲生長的影響

圖1 不同初始pH對灰樹花菌絲生長的影響

圖2 鄰苯二酚氧化酶、愈創(chuàng)木酚氧化酶活性

由圖1可知，灰樹花在不同初始pH的培養(yǎng)基中，其生長量不同。pH2、4時菌絲生物量最大，初始pH達4后菌絲生物量急劇降低，在pH大于6以后菌絲生物量變化不明顯，pH變化對其生長影響不大。

2.5 灰樹花菌絲胞外酶活性測定

圖2、圖3結果表明，在整個發(fā)酵培養(yǎng)期間，淀粉酶、羧甲基纖維素酶、鄰苯二酚氧化酶、愈創(chuàng)木酚氧化酶均有活性，且其酶活性高峰交替出現(xiàn)。其中鄰苯二酚氧化酶、愈創(chuàng)木酚氧化酶酶活性相似，均在46 h時出現(xiàn)第一次高峰，之后活性逐漸降低，但愈創(chuàng)木酚氧化酶在165 h后又小幅度上升，但二者總體呈下降趨勢。羧甲基纖維素酶也在46 h時出現(xiàn)第一次酶活性高峰，之后逐漸降低，在97 h時酶活性降到最低，之后隨培養(yǎng)時間的增長酶活性又逐漸上升，且在整個培養(yǎng)期羧甲基纖維素酶活性最高。淀粉酶的活性高峰則出現(xiàn)在培養(yǎng)后期，在整個發(fā)酵培養(yǎng)過程中其活性波動較大，雖然在前期會出現(xiàn)一個小的高峰（46 h），但之后仍呈下降趨勢，到97 h達到最低點，之后酶活性迅速上升，在117 h達到第二次高峰，但之后又緩慢下降，在143 h后又上升，但總體呈增強趨勢。在整個發(fā)酵培養(yǎng)過程中，灰樹花雖然在早期就開始利用培養(yǎng)液中的糖類物質、木屑纖維素及淀粉類物質，而淀粉類物質在后期利用更多。

3 小結與討論

不同碳源對灰樹花菌絲生長均有影響，最適碳源為葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖，灰樹花菌絲生長較好，菌絲干重較大；但從經(jīng)濟角度看，葡萄糖為其最適碳源；這一結果與前人研究相似[11]。所用灰樹花菌株的最佳氮源是硝酸銨，這一點與陳石良等人對灰樹花的研究結果不一致，其主要原因可能是灰樹花菌株之間存在差異[12]。試驗表明灰樹花菌絲生長的最佳礦質元素是磷酸二氫鉀，這與張松等人的研究結果相同[13]?；覙浠ňz生長的最適初始pH 2～4，由于沒有設計pH 0～2，其結果還有待進一步研究。

圖3 淀粉酶、羧甲基纖維素酶活性

灰樹花在液體發(fā)酵培養(yǎng)時，淀粉酶、羧甲基纖維素酶、鄰苯二酚氧化酶、愈創(chuàng)木酚氧化酶這4種酶均有活性，表明灰樹花具有降解多糖類物質和纖維素、木質素的能力，這與倪新江等人的結論一致[14]。其淀粉酶、羧甲基纖維素酶、鄰苯二酚氧化酶、愈創(chuàng)木酚氧化酶這4種酶的酶活性高峰期交替出現(xiàn)，具有明顯的活性變化。由于試驗測定的時間較短，沒能更加完整的體現(xiàn)灰樹花培養(yǎng)期間酶活性變化的規(guī)律，有待今后進一步研究。