miRNA-210-3p對缺氧誘導海馬神經(jīng)細胞HT22凋亡的影響

丁 娜，黃 月，田 龍

1)鄭州人民醫(yī)院神經(jīng)內科 鄭州 450003 2)河南省人民醫(yī)院神經(jīng)內科 鄭州 450003

缺血誘發(fā)的腦組織功能損傷是臨床上常見的病理過程，腦缺血能夠誘發(fā)神經(jīng)功能障礙，而神經(jīng)細胞凋亡是神經(jīng)功能障礙發(fā)生的重要原因之一[1]。miRNA是一種非編碼的小RNA，在人體的多種組織中均有表達，不僅參與調控正常細胞的生理功能，還參與多種疾病的發(fā)生[2-3]。miRNA-210-3p在阿爾茨海默病、腫瘤、缺氧腦水腫等疾病中均有重要作用，還能夠調控細胞凋亡等；大鼠腦組織缺氧缺血后miRNA-210-3p表達下調，miRNA-210-3p過表達可以減輕缺氧缺血誘發(fā)的腦組織水腫程度；過表達miRNA-210-3p具有抗神經(jīng)細胞凋亡的作用[4-7]。本實驗通過體外構建缺氧海馬神經(jīng)元HT22細胞損傷模型，探討miRNA-210-3p對缺氧條件下海馬神經(jīng)細胞凋亡的影響及機制，為明確腦缺氧神經(jīng)損傷發(fā)生機制及miRNA-210-3p在海馬神經(jīng)元損傷中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1細胞及主要試劑海馬神經(jīng)元HT22細胞購自湖南豐暉生物科技有限公司，以含有100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，同時在培養(yǎng)液中添加體積分數(shù)10%的胎牛血清，置于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)?；罨虲aspase-3(Cleaved Caspase-3)抗體購自美國BD公司；miRNA-210-3p模擬物和陰性對照模擬物購自美國Cellecta公司；超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性檢測試劑盒和丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒均購自南京建成生物研究所；活化型Caspase-9(Cleaved Caspase-9)抗體購自美國Abbkine公司；所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；cDNA合成試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2細胞轉染和分組HT22細胞分成4組，分別為對照組、缺氧組、陰性對照+缺氧組、miRNA-210-3p+缺氧組。缺氧處理方法：HT22細胞用不含血清的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，放在連續(xù)充入體積分數(shù)95% N2和體積分數(shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中連續(xù)缺氧培養(yǎng)3 h。放在不充入缺氧氣體的培養(yǎng)箱(37 ℃、體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱)中培養(yǎng)的細胞作為對照組。陰性對照+缺氧組、miRNA-210-3p+缺氧組分別轉染陰性對照模擬物、miRNA-210-3p模擬物，并在轉染后24 h進行缺氧培養(yǎng)3 h。陰性對照模擬物、miRNA-210-3p模擬物轉染方法同Lipofectamine 2000說明書。實驗重復3次。

1.3qRT-PCR檢測海馬神經(jīng)細胞中miRNA-210-3p的表達各組細胞中添加1 mL的Trizol裂解溶液，按照常規(guī)方法提取總RNA；以10 μL的反轉錄體系合成cDNA，反轉錄條件：37 ℃反應15 min，85 ℃反應5 s，4 ℃終止反應。miRNA-210-3p上游引物為5’-ATTATACAATAGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’，下游引物為5’-TAAAATATTACTGTGCGTGTGA CAGCGG-3’；內參U6上游引物為5’-CGTGCTTCG GCAGCACATAT-3’，下游引物為5’-TTTGCGTGT CATCCTTGCG-3’。PCR反應體系：5.0 μL 5×SYBR Green熒光染料，3.4 μL DEPC水，0.2 μL上、下游引物，1.0 μL cDNA樣品，0.2 μL ROX。PCR程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算miRNA-210-3p的相對表達量。實驗重復3次。

1.4流式細胞術檢測細胞凋亡情況收集4組細胞，分別添加400 μL的Loading Buffer混勻后，依次添加各5 μL的PI和Annexin V-FITC溶液，混勻后置于避光條件下結合15 min。用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。實驗重復3次。

1.5Westernblot檢測CleavedCaspase-3和CleavedCaspase-9蛋白表達水平4組細胞分別添加體積比100∶1的RIPA、PMSF裂解液，充分裂解后，吸取上清，添加至5×上樣緩沖液中混勻煮沸5 min。分別配制100 g/L的電泳分離膠和50 g/L的電泳濃縮膠，在每個孔中加入40 μg的蛋白樣品，調整電壓(濃縮膠中的電壓為80 V，分離膠中的電壓為110 V)，觀察溴酚藍電泳至分離膠的底部以后方可停止電泳。取出凝膠，在300 mA電流條件下把凝膠上的蛋白轉移到NC膜上，轉膜操作置于冰上進行。稱取5 g的脫脂奶粉加入到100 mL的TBST中配制成封閉液，把NC膜放在封閉液中孵育1 h后，再把NC膜放在Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9抗體反應液中孵育2 h，繼續(xù)與二抗反應液結合反應2 h，添加ECL顯色液，用Quantity One掃描曝光條帶的灰度值，內參為GAPDH。目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。實驗重復3次。

1.6細胞中SOD、GSH-Px活性和MDA含量檢測4組細胞按照1.2方法處理以后，分別用硫代巴比妥酸法檢測MDA含量，用二硫代二硝基苯甲酸法檢測GSH-Px活性，用水溶性四唑鹽法檢測SOD活性，步驟均同試劑盒說明書，結果均以對照組細胞為參照。實驗重復3次。

1.7統(tǒng)計學處理采用SPSS 21.0進行統(tǒng)計學處理。4組細胞中miRNA-210-3p相對表達量、凋亡率、Cleaved Caspase-3蛋白相對表達量、Cleaved Caspase-9蛋白相對表達量、SOD活性、GSH-Px活性和MDA含量的比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 4組細胞中miRNA-210-3p表達水平的比較結果見表1。從表1可以看出，miRNA-210-3p模擬物轉染后的海馬神經(jīng)細胞經(jīng)缺氧處理后，細胞中miRNA-210-3p表達水平升高。

表1 4組細胞中miRNA-210-3p相對表達量的比較

F=36.830，P<0.001；*：與缺氧組、陰性對照+缺氧組比較，P<0.05

2.2 4組細胞凋亡率和CleavedCaspase-3、CleavedCaspase-9蛋白表達水平的比較結果見圖1和表2。可以看出，缺氧處理后的海馬神經(jīng)細胞凋亡率升高，細胞中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表達水平升高；miRNA-210-3p模擬物轉染后的海馬神經(jīng)細胞經(jīng)缺氧處理后，細胞凋亡率降低，細胞中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表達水平下降。

1：對照組；2：缺氧組；3：陰性對照+缺氧組；4：miRNA-210-3p+缺氧組

圖1 4組細胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白的表達

*：與對照組比較，P<0.05；#：與缺氧組、陰性對照+缺氧組比較，P<0.05

2.3 4組細胞中SOD、GSH-Px活性和MDA含量的比較結果見表3?？梢钥闯觯毖跆幚砗蟮暮ｑR神經(jīng)細胞中SOD、GSH-Px活性降低，MDA含量升高；miRNA-210-3p模擬物轉染后的海馬神經(jīng)細胞經(jīng)缺氧處理后，細胞中SOD、GSH-Px活性升高，MDA含量降低。

表3 4組細胞中SOD、GSH-Px活性和MDA含量比較(n=3)

*：與對照組比較，P<0.05；#：與缺氧組、陰性對照+缺氧組比較，P<0.05

3 討論

缺血性腦疾病嚴重危害人類健康，缺氧缺血條件可以引起海馬神經(jīng)細胞凋亡，造成海馬組織結構損傷，從而導致腦組織功能障礙[8]。本實驗的結果表明，缺氧處理后的海馬神經(jīng)細胞凋亡率升高，說明成功構建了缺氧海馬神經(jīng)細胞體外損傷模型。

miRNA是一類由21～23個堿基組成的單鏈RNA，其不含有開放閱讀框，不能編碼蛋白質，參與細胞生長分化、血管形成、新陳代謝等過程[9-11]。目前發(fā)現(xiàn)miRNA-210-3p具有抑制電子傳遞鏈復合體表達、促進細胞遷移和血管新生等作用，在腫瘤等疾病中具有重要作用[12]。最近的研究[13]顯示，缺氧缺血后的大鼠腦組織中miRNA-210-3p表達下降，miRNA-210-3p具有抑制缺血大鼠腦組織水腫的作用。另外，miRNA-210-3p具有抑制氧化應激條件下心肌細胞凋亡的作用，下調miRNA-210-3p具有誘導乳腺癌細胞凋亡的作用[14]。本實驗的結果表明，缺氧處理后的海馬神經(jīng)細胞中miRNA-210-3p表達水平降低，而上調miRNA-210-3p表達可以降低缺氧誘導的海馬神經(jīng)細胞凋亡率，這說明miRNA-210-3p具有抗缺氧海馬神經(jīng)細胞凋亡的作用。

細胞凋亡在機體內環(huán)境穩(wěn)態(tài)維持中具有重要作用，無論是病理性還是生理性的細胞凋亡都受到細胞內多種基因的嚴格調控作用。目前研究較為透徹的細胞凋亡機制與Caspase級聯(lián)反應有關，Caspase蛋白家族在細胞凋亡過程中發(fā)揮不同的功效，Caspase-3和Caspase-9分別位于該凋亡反應的下游和上游，在細胞凋亡中發(fā)揮執(zhí)行和起始因子的作用，二者只有被活化才具有誘導細胞凋亡的功能[15-16]。本實驗的結果顯示，上調miRNA-210-3p后的海馬神經(jīng)細胞經(jīng)缺氧處理后，細胞中的Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表達水平降低，提示上調miRNA-210-3p可能通過抑制Caspase來減少缺氧誘導的海馬神經(jīng)細胞凋亡。

眾所周知，腦缺血損傷與組織氧化應激有關，而組織內氧化應激反應可以激活細胞中Caspase凋亡反應，從而誘導細胞凋亡[17]。MDA是細胞內脂質發(fā)生過氧化的產物，而細胞內抗氧化酶活性降低導致細胞內過量的氧自由基積累是脂質過氧化反應發(fā)生的重要原因，SOD、GSH-Px是廣泛存在于細胞內的抗氧化酶，其活性的高低與細胞氧化應激水平有關[18-19]。本實驗的結果表明，上調miRNA-210-3p可以提高缺氧條件下海馬神經(jīng)細胞中SOD、GSH-Px活性，同時降低細胞中MDA含量，說明上調miRNA-210-3p能夠抑制缺氧誘導的海馬神經(jīng)細胞氧化損傷。

總之，上調miRNA-210-3p在缺氧誘導的海馬神經(jīng)損傷中發(fā)揮保護作用，其可能通過抑制細胞氧化應激、下調細胞Caspase凋亡反應發(fā)揮抗細胞凋亡的作用，這為研究缺氧海馬神經(jīng)細胞損傷提供了參考。