大鼠皮膚癌痛模型的建立

黃厚芹， 劉岳鵬， 吳 曉， 何學(xué)明

1)蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬連云港市東方醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科 江蘇連云港 222042 2)蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬連云港市東方醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心 江蘇連云港 222042 3)東南大學(xué)附屬江陰醫(yī)院老年科 江蘇江陰 214400

15261379088@139.com;吳曉，通信作者，女，1991年10月生，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：慢性疼痛的發(fā)病機(jī)制，E-mail:15743968068@qq.com

為了闡明癌痛的機(jī)制，合適的動物模型不可或缺。骨癌痛模型是目前應(yīng)用最廣泛的動物模型，但是其制作較為復(fù)雜[1]。皮膚癌痛模型以其便利性獲得了較為普遍的關(guān)注[2-4]。目前最常用的皮膚癌痛模型是在小鼠足底皮下注射B16黑色素瘤細(xì)胞制作而成[2-3]，然而，該模型在實踐過程中顯示出易轉(zhuǎn)移、成模時間長、小鼠存活率低等缺點，因此有必要建立一種新的皮膚癌痛模型。另外，大鼠是疼痛機(jī)制研究較常用的動物，已經(jīng)積累了豐富的研究資料。研究[5]顯示，將大鼠乳腺癌Walker256細(xì)胞接種到大鼠脛骨或跟骨骨髓腔內(nèi)制作的骨癌痛模型表現(xiàn)出對骨組織明顯的侵蝕，體現(xiàn)了癌痛發(fā)生的特點之一 ——破壞機(jī)體組織，提示W(wǎng)alker256可能是一種適用于制作大鼠皮膚癌痛模型的細(xì)胞。作者探討了將Walker256細(xì)胞接種于大鼠足底皮下建立大鼠皮膚癌痛模型的可行性。

1 材料與方法

1.1材料健康成年雄性SD大鼠，體重180～220 g，購自南京醫(yī)科大學(xué)。分籠飼養(yǎng)，實驗室溫度保持在22～24 ℃，濕度保持在40%～60%，12 h晝夜周期光照，自由進(jìn)食、飲水。本實驗遵守實驗室操作規(guī)范及國際疼痛學(xué)會關(guān)于應(yīng)用清醒動物進(jìn)行疼痛實驗研究綱要的要求。Walker256細(xì)胞系購自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫，由作者所在醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心實驗室凍存?zhèn)溆?。Masson染色試劑盒購自福建邁新公司。山羊抗鼠GFAP抗體購自Santa Cruz公司，山羊抗鼠Iba1抗體購自Abcam公司，神經(jīng)生長因子(nerve growth factor, NGF)ELISA檢測試劑盒購自RD公司，白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1beta, IL-1β)ELISA檢測試劑盒購自Alpco公司，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)ELISA檢測試劑盒購自Merck Millipore公司。VonFrey動態(tài)足底觸覺測量儀(意大利UGO公司)，輻射熱測痛儀(IITC公司)，PV-200足趾容積測量儀(成都泰盟科技有限公司)。

1.2Walker256細(xì)胞的復(fù)蘇取出Walker256細(xì)胞的凍存管，37 ℃水浴中快速振蕩解凍。細(xì)胞復(fù)蘇后放入離心管中，1 000 r/min離心 5 min，棄上層液體，加入等量的PBS，輕輕吹打混勻，再次1 000 r/min離心 5 min，棄上層液體，加少量PBS懸浮細(xì)胞。吸取細(xì)胞懸液并用PBS稀釋至3 mL，輕輕吹打混勻；利用細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)細(xì)胞，并以PBS配制密度為 4×107個/mL的細(xì)胞懸液，置于冰箱內(nèi)備用。

1.3大鼠皮膚癌痛模型的制備及分組30只大鼠隨機(jī)分為正常對照組、假接種組及模型組，每組10只。后2組大鼠以異氟烷麻醉，用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇消毒足墊皮膚，模型組用1 mL注射器將密度為4×107個/mL的 Walker256細(xì)胞懸液(200 μL)緩慢注入大鼠足墊皮下，針頭停滯 30 s～1 min后緩慢退針，局部按壓 1 min；假接種組接種等量高溫滅活Walker256細(xì)胞。大鼠蘇醒后送回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。正常對照組不接種。

1.4大鼠后足跖面腫瘤生長情況觀察接種前1天及接種后第 2、5、8、11、14、17天，異氟烷麻醉大鼠，觀察足跖面腫瘤生長情況，并用PV-200足趾容積測量儀測量大鼠足體積。以接種前1天所測足體積為基礎(chǔ)值，接種后所測足體積減去基礎(chǔ)值即為增量足體積。

1.5機(jī)械痛敏檢測分別于接種前1天，接種后第2、5、8、11、14、17天采用VonFrey動態(tài)足底觸覺測量儀測定大鼠機(jī)械縮足閾值。將大鼠置于底部為金屬網(wǎng)格的有機(jī)玻璃盒子(30 cm×20 cm×15 cm)中，適應(yīng)20 min后于靜息狀態(tài)下開始測定。VonFrey絲由下向上垂直刺激大鼠足墊部皮膚，設(shè)定10 s內(nèi)刺激強度由0逐漸升高，當(dāng)出現(xiàn)快速縮足反應(yīng)時，刺激自動停止，記錄刺激強度(以g為單位)。共測3次，每次間隔3 min，取其平均值作為該時間點的機(jī)械縮足閾值。

1.6熱痛敏檢測分別于接種前1天，接種后第2、5、8、11、14、17天采用輻射熱測痛儀測定大鼠熱縮足潛伏期。將大鼠置于22 cm×12 cm×12 cm的盒中，底部為光滑透明玻璃板，適應(yīng)20 min后，用輻射熱測痛儀照射大鼠后肢足墊部(左、右足不拘，習(xí)慣性選右足)。當(dāng)大鼠抬足回避時停止照射并記錄照射時間，即為大鼠的熱縮足潛伏期。熱輻射強度設(shè)定為能引起大鼠在20 s內(nèi)縮足的強度，為了防止大鼠足底被燙傷，將熱縮足潛伏期的上限設(shè)為30 s，如果超過30 s大鼠仍未抬足，熱刺激將自動終止，并記錄為30 s。照射3次，每次間隔5～6 min，取其平均值作為該時間點的熱縮足潛伏期。

1.7大鼠皮膚組織細(xì)胞因子水平測定另取大鼠，分為3組，同上處理，分別用于1.7和1.8中檢測。假接種組(接種后第3天)和模型組(接種后第3、7、14天)各取6只大鼠，取接種皮膚組織，采用ELISA法檢測NGF、IL-1β和TNF-α水平，實驗步驟按照說明書進(jìn)行。

1.8足底皮膚組織病理學(xué)檢測和脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化檢測接種后第7、14天，熱痛敏及之前的檢測完成后，3組各取4只大鼠，麻醉下迅速暴露心臟，用40 g/L多聚甲醛經(jīng)左心室灌注處死大鼠，分別取足底皮膚組織和L4～L6段脊髓組織。皮膚組織用40 g/L多聚甲醛固定24 h后，加入400 g/L蔗糖脫水，冰凍切片，Masson染色(參照試劑盒說明書)，顯微鏡(×200)下觀察。脊髓組織常規(guī)固定，加入400 g/L蔗糖脫水，冰凍連續(xù)切片(片厚15 μm)，免疫組化法檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Ibal的表達(dá)。首先用體積分?jǐn)?shù)3%雙氧水處理10 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，然后加入含體積分?jǐn)?shù)5%驢血清的封閉液，室溫孵育30 min，再加入山羊抗鼠GFAP抗體(1∶200稀釋)或山羊抗鼠Iba1抗體(1∶400稀釋)，4 ℃孵育12 h后，PBS洗滌3次，加入相應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h后，PBS洗滌3次，DAB顯色，脫水透明后封片，顯微鏡下觀察。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理用 SPSS 22.0處理數(shù)據(jù)。采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析比較3組大鼠疼痛行為學(xué)數(shù)據(jù)的差異；采用單因素方差分析比較大鼠形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)和細(xì)胞因子水平的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1腫瘤生長情況及足體積的變化模型組從接種后第2天開始出現(xiàn)不同程度的紅腫，隨著時間的推移，紅腫情況進(jìn)一步加重，至觀察結(jié)束仍無消退跡象。假接種組從接種后第2天開始出現(xiàn)紅腫，第8天紅腫消退。正常對照組無變化。見圖1。

模型組大鼠增量足體積從接種后第2天開始逐漸增加，假接種組個別大鼠增量足體積在接種后第2、5、8天出現(xiàn)小幅升高，正常對照組無變化(圖2)。

A：正常對照組；B：假接種組(接種后第5天)；C：模型組(接種后第14天)；D：模型組(接種后第17天)

圖1接種不同時間3組大鼠足底的大體形態(tài)

圖2 接種不同時間3組大鼠增量足體積比較

2.2機(jī)械痛敏檢測接種前1天及接種后第2、5天，各組大鼠機(jī)械縮足閾值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。正常對照組和假接種組的機(jī)械縮足閾值穩(wěn)定在一定的水平。模型組的機(jī)械縮足閾值逐漸降低，與假接種組比較，在接種后第8、 11、14、17天，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

表1 不同接種時間3組大鼠機(jī)械縮足閾值比較(n=10) g

F組間=455.756，F(xiàn)時間=49.339，F(xiàn)交互=81.762，P均<0.001；*：與假接種組比較，P<0.05

2.3熱痛敏檢測接種前1天及接種后第2、5天，各組大鼠熱縮足潛伏期比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。正常對照組的熱縮足潛伏期穩(wěn)定在一定的水平。假接種組的熱縮足潛伏期在接種后第2天最低，隨后上升，在接種后第8天與正常對照組相當(dāng)。模型組的熱縮足潛伏期逐漸降低，與假接種組比較，在接種后第8、 11、14及17天差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。

表2 不同接種時間3組大鼠熱縮足潛伏期比較(n=10) s

F組間=254.245，F(xiàn)時間=35.689，F(xiàn)交互=75.658，P均<0.001；*：與假接種組比較，P<0.05

2.4模型組和假接種組皮膚組織細(xì)胞因子水平檢測模型組大鼠接種腫瘤細(xì)胞后，荷瘤皮膚組織內(nèi)NGF、IL-1β和TNF-α的水平隨腫瘤的生長而增加，與假接種組(接種后第3天)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表3)。假接種組的細(xì)胞因子水平以接種后第3天為代表，因為預(yù)實驗顯示隨時間延長假接種組細(xì)胞因子水平無明顯變化。

表3 3組大鼠接種部位皮膚 組織內(nèi)NGF、IL-1β、TNF-α水平比較(n=6) pg/g

*:與假接種組比較，P<0.05

2.5足底皮膚組織病理學(xué)表現(xiàn)Masson染色后光鏡下可見模型組接種后第14天大鼠足墊部皮下組織

出現(xiàn)大量腫瘤細(xì)胞浸潤，腫瘤細(xì)胞生長活躍(圖3)。

小圖為腫瘤細(xì)胞放大顯示圖；紅色染色為腫瘤組織，其間夾雜部分藍(lán)染細(xì)胞

圖3模型組(接種后 第14天)皮膚組織腫瘤細(xì)胞生長情況

2.6脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化檢測假接種組接種后第3天大鼠脊髓無明顯活化的小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞，而模型組接種后第7天及14天脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞活化明顯(圖4)。

A：假接種組(接種后第3天)GFAP的表達(dá)；B、D：模型組(接種后第7、14天)GFAP的表達(dá)；F：假接種組(接種后第3天)Iba1的表達(dá)；G、I：模型組(接種后第7、14天)Iba1的表達(dá)；C、E、H、J：各自圖片指示位置的放大圖，黑色三角符號指示放大圖所在位置

圖4 3組大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞活化檢測(×200)

3 討論

本研究嘗試將Walker256細(xì)胞注射到大鼠足底皮下，以制作大鼠皮膚癌痛模型，結(jié)果顯示，接種后大鼠足底皮膚紅腫，同時，接種后第8、11、14、17天，大鼠機(jī)械縮足閾值和熱縮足潛伏期均逐漸降低，較高程度模擬了癌癥造成的疼痛。癌痛發(fā)生的機(jī)制現(xiàn)在還不完全清楚，有兩點是較為公認(rèn)的：第一，神經(jīng)損傷因素，即瘤體擴(kuò)張機(jī)械壓迫或者腫瘤細(xì)胞浸潤破壞周圍組織結(jié)構(gòu)和神經(jīng)纖維而引起疼痛。骨癌痛模型和小鼠皮膚癌痛模型都顯示出腫瘤細(xì)胞對原有組織的破壞[4,6]。疼痛刺激傳入中樞會迅速激活星形膠質(zhì)細(xì)胞，阻斷星形膠質(zhì)細(xì)胞激活或其相關(guān)信號通路均可鎮(zhèn)痛[7]，表明星形膠質(zhì)細(xì)胞在疼痛中發(fā)揮了重要作用。另外，癌痛刺激傳入中樞使小膠質(zhì)細(xì)胞被大量激活[8]，脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化是神經(jīng)損傷的常見表現(xiàn)之一[9]，小膠質(zhì)細(xì)胞活化在骨癌痛模型已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)[10]，但在皮膚癌痛模型中是否存在尚未見報道。本研究中Masson染色顯示，接種的癌細(xì)胞破壞了皮膚組織，且免疫組化顯示脊髓有星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。第二，化學(xué)因子致痛。腫瘤微環(huán)境中產(chǎn)生的化學(xué)因子降低了局部神經(jīng)纖維的反應(yīng)閾值，引起神經(jīng)過敏。研究[8]表明 NGF、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、 IL-1β、TNF-α、白細(xì)胞介素(interleukin 6，IL-6)和轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor, TGF-β)等都參與了癌痛的形成。本研究顯示荷瘤皮膚組織內(nèi)NGF、IL-1β和TNF-α的表達(dá)增加，提示炎癥因子可能參與了Walker256細(xì)胞導(dǎo)致的痛覺過敏。

該模型還體現(xiàn)出以下優(yōu)點。首先，制作過程簡便。骨癌痛模型的制作要求培養(yǎng)的Walker256細(xì)胞要經(jīng)過腹腔接種培養(yǎng)出活性較好的細(xì)胞[1]，而在本研究中，培養(yǎng)的Walker256細(xì)胞直接接種即可成功在皮下生長；其次，動物死亡率低，實驗過程中未觀察到動物死亡；第三，腫瘤局限，不轉(zhuǎn)移。

模型制作中需要注意以下幾點。①建立此癌痛模型時宜選用大鼠建模。預(yù)實驗過程中曾試用昆明小鼠建模，未觀察到腫瘤細(xì)胞的生長。②假接種組在最初幾天，動物足部也會表現(xiàn)出一定程度紅腫，足體積測量也有一定程度的增加，但是隨后紅腫情況消失，猜測為滅活腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)大鼠短暫免疫反應(yīng)所致。

總之，SD 大鼠足底注射乳腺癌Walker256細(xì)胞可建立皮膚癌痛模型，該模型成功率高，死亡率低，簡單易行，為探討癌痛機(jī)制提供了便利的研究工具。