阿帕替尼對肺腺癌H1650細胞增殖、活性氧水平和凋亡的影響

宋永安，劉海洋，張曉菊

鄭州大學(xué)人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 鄭州 450003

在全球范圍內(nèi)，肺癌是發(fā)病率較高的癌癥之一，患者的5 a生存率低于15%[1-3]。雖然目前治療方法非常豐富，但是肺癌患者的治療效果和預(yù)后依然令人擔憂[4-5]。阿帕替尼是我國自主研發(fā)的一種抗血管新生靶向藥物，能阻斷血管內(nèi)皮生長因子與其受體結(jié)合后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而強烈抑制腫瘤血管生成并發(fā)揮抗腫瘤作用[6]。臨床試驗[7]證實，阿帕替尼用于標準化療失敗的晚期胃癌患者時，可以觀察到明確的治療效果和顯著的生存獲益。目前，迫切需要尋找新的藥物以抑制肺癌細胞的增殖，從而改善肺癌患者的療效[8]。H1650是最常見的肺腺癌細胞系，作者觀察了阿帕替尼對肺腺癌H1650細胞體外活性的影響，為臨床治療肺癌提供理論依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1細胞和主要試劑H1650細胞購自中國科學(xué)院細胞庫；阿帕替尼購自中國美倫生物有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自以色列BI公司；CCK-8試劑購自日本同仁有限公司；活性氧(ROS)和Annexin V-FITC檢測試劑盒購自中國上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Cleaved Caspase-3抗體購自中國恩晶生物公司。

1.2細胞培養(yǎng)用RPMI 1640完全培養(yǎng)基在60 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)H1650細胞，完全培養(yǎng)基中含體積分數(shù)10%胎牛血清。將H1650細胞置于含有體積分數(shù)5% CO2、飽和濕度的37 ℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。細胞長至大約80%融合時傳代1次，每2 d更換1次培養(yǎng)基。取處于對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.3不同濃度阿帕替尼對H1650細胞增殖的影響用胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的H1650細胞，用適當比例的培養(yǎng)基稀釋，然后進行計數(shù)，每孔3 000個細胞均勻接種于96孔板中。24 h后棄去原有培養(yǎng)基，加入含阿帕替尼[0.000(陰性對照)、0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000、32.000、64.000 μmol/L]的培養(yǎng)基。72 h后每孔加入10 μL CCK-8孵育4 h。用酶標儀于450 nm波長處測定吸光度值，計算細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率=(1-阿帕替尼組吸光度值/陰性對照吸光度值)×100%；計算阿帕替尼對H1650細胞的IC50。實驗重復(fù)3次。

1.4不同濃度阿帕替尼對H1650細胞克隆形成能力的影響將H1650細胞接種在6孔板中，每孔1 000個細胞，24 h后棄去培養(yǎng)基，然后加入不同濃度(0、2、4、8 μmol/L)的阿帕替尼孵育9 d后，用PBS沖洗細胞。將細胞在多聚甲醛中固定20 min，再次清洗細胞。用結(jié)晶紫染色30 min，清洗后在室溫下風干，用相機拍照并用Image J軟件分析克隆形成率，克隆形成率=給藥組細胞數(shù)/對照組細胞數(shù)×100%。實驗重復(fù)3次。

1.5不同濃度阿帕替尼對H1650細胞內(nèi)ROS水平的影響將H1650細胞以每孔2×105個接種于6孔板中，過夜后每孔分別加入含0、8、16、32 μmol/L 阿帕替尼的培養(yǎng)基。24 h后用胰蛋白酶消化、收集細胞，PBS洗滌2次后，用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA 1 000倍，孵育細胞20 min。為了防止細胞表面殘損的DCFH-DA干擾實驗結(jié)果，細胞需要用無血清培養(yǎng)基洗滌3次。用流式細胞儀檢測高熒光強度細胞所占比例，即代表細胞內(nèi)的ROS水平。實驗重復(fù)3次。

1.6不同濃度阿帕替尼對H1650細胞凋亡的影響將H1650細胞接種在6孔板(2×105個/孔)中孵育24 h，然后用不同濃度(0、8、16、32 μmol/L)的阿帕替尼培養(yǎng)48 h。收獲細胞并用冷PBS洗滌2次，然后重懸于含有5 μL Annexin V-FITC染色液的500 μL結(jié)合緩沖液中。將細胞在黑暗中溫育20 min，然后將5 μL PI染色液加入細胞懸液中。30 min內(nèi)用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。實驗重復(fù)3次。

1.7不同濃度阿帕替尼對H1650細胞CleavedCaspase-3蛋白表達的影響采用Western blot法。將H1650細胞接種于培養(yǎng)皿中，加不同濃度(0、8、16、32 μmol/L)的阿帕替尼培養(yǎng)48 h，胰蛋白酶消化、收集細胞，PBS清洗2次，用含有蛋白酶抑制劑混合物的RIPA緩沖液在冰上裂解細胞，4 ℃ 11 000×g離心20 min，取上清用BCA試劑盒測蛋白濃度，然后取上清與6×Loading Buffer按體積比5∶1混勻，100 ℃水浴鍋煮蛋白10 min。取等量蛋白樣品在SDS-PAGE中電泳，然后將其轉(zhuǎn)移到NC膜上，取出NC膜于50 g/L脫脂牛奶中室溫封閉2 h，加入一抗孵育，4 ℃過夜，次日用TBST洗膜3次，每次10 min。加辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜，每次10 min，共3次，利用化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白表達水平。采用GAPDH作為內(nèi)參，用Image J軟件分析目的蛋白相對表達量。實驗重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)分析。不同組間細胞增殖抑制率、克隆形成率、ROS水平、細胞凋亡率及Cleaved Caspase-3蛋白相對表達量的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1阿帕替尼對H1650細胞增殖的影響細胞增殖抑制率測定結(jié)果見表1。阿帕替尼對H1650細胞的IC50為18.37 μmol/L。

表1各組H1650細胞增殖抑制率的比較

%

F=1 976.258，P<0.001；*:兩兩比較，P均<0.05

2.2阿帕替尼對H1650細胞克隆形成能力的影響結(jié)果見圖1。可以看出，阿帕替尼可減弱H1650細胞的克隆形成能力。0、2、4、8 μmol/L阿帕替尼組H1650細胞克隆形成率分別為(100.00±3.67)%、(46.67±2.80)%、(37.47±2.37)%、(8.39±2.23)%，4組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=366.455，P<0.001)；且組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。

2.3阿帕替尼對H1650細胞內(nèi)ROS水平、凋亡率、CleavedCaspase-3蛋白表達的影響結(jié)果見圖2、表2?？芍?，阿帕替尼可提高細胞內(nèi)ROS水平，促進細胞凋亡和Cleaved Caspase-3蛋白的表達。

A：0 μmol/L阿帕替尼組；B：2 μmol/L阿帕替尼組；C：4 μmol/L阿帕替尼組；D：8 μmol/L阿帕替尼組

1：0 μmol/L阿帕替尼組；2：8 μmol/L阿帕替尼組；3：16 μmol/L阿帕替尼組；4：32 μmol/L阿帕替尼組

圖2 各組H1650細胞中 Cleaved Caspase-3蛋白表達的檢測結(jié)果

*:兩兩比較，P均<0.05；#：與0 μmol/L阿帕替尼組比較，P<0.05

3 討論

目前，我國肺癌的發(fā)病率越來越高，我國肺癌的病死率在所有癌癥中處于第1位[9]?；熓浅Ｓ玫闹委煼伟┑姆椒ǎ腔熕幬镆驗椴涣挤磻?yīng)而在臨床應(yīng)用中受到限制，迫切需要尋找新的治療藥物[10]。阿帕替尼是我國自主研發(fā)的抗血管新生靶向藥，具有較少的不良反應(yīng)。該研究發(fā)現(xiàn)阿帕替尼能夠直接抑制肺腺癌H1650細胞增殖，有望為臨床治療肺癌提供新思路。

ROS生成增多與細胞死亡密切相關(guān)。ROS能直接作用于細胞膜，氧化磷脂雙分子層，損害細胞膜的功能，同時細胞膜損傷后又能產(chǎn)生自由基，造成級聯(lián)反應(yīng)，過度產(chǎn)生的自由基還能使細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA等發(fā)生交聯(lián)，引發(fā)細胞死亡[11]。ROS還能損傷細胞核中的DNA，使細胞有絲分裂發(fā)生紊亂，最終導(dǎo)致細胞凋亡[12]。至今，已經(jīng)鑒定出大量的ROS產(chǎn)生劑，如丙卡巴肼，依靠ROS產(chǎn)生發(fā)揮其抗癌功效[13]。本實驗證實，阿帕替尼可以增加H1650細胞內(nèi)ROS水平。ROS在細胞凋亡中發(fā)揮著重要作用。Caspase是與細胞凋亡相關(guān)的蛋白酶家族，它們存在于細胞質(zhì)中，其激活后可以促進細胞凋亡的發(fā)生。人類Caspase成員較多,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有11個成員,其中Caspase-3是最重要的成員之一[14]。

有文獻[15]報道，阿帕替尼對人肝癌HepG2細胞的IC50為8.4 μmol/L。研究[16]發(fā)現(xiàn)，阿帕替尼能抑制人結(jié)腸癌HCT-116細胞增殖，促進HCT-116細胞凋亡，并且能激活Caspase家族通路。本研究結(jié)果顯示，阿帕替尼可抑制肺癌H1650細胞增殖，其IC50為18.37 μmol/L。在低于IC50時，阿帕替尼(2、4、8 μmol/L)就能阻礙H1650細胞集落形成。在IC50附近時，阿帕替尼還可以通過提高H1650細胞內(nèi)ROS水平，促進細胞內(nèi)氧化反應(yīng)的發(fā)生。作者還發(fā)現(xiàn)阿帕替尼作用于H1650細胞后，早期和晚期細胞凋亡率明顯增加，Cleaved Caspase-3表達水平升高，提示其能夠通過促Cleaved Caspase-3的表達進一步激活Caspase凋亡相關(guān)通路，最終使肺癌H1650細胞走向凋亡。

綜上所述，阿帕替尼可促進H1650細胞內(nèi)ROS的生成，進而誘發(fā)H1650細胞凋亡，使其增殖受到抑制，有望成為治療肺癌的新藥物。