云南榧樹內(nèi)生真菌TNF53的分子鑒定及抑菌活性研究

隋國強(qiáng) 馬長樂 張金麗 李博文 李靖

摘要：為探明菌株TNF53的分類地位及其抑菌活性，采用試劑盒法、濾紙片擴(kuò)散法和對峙培養(yǎng)法對從云南榧樹葉片上分離得到的內(nèi)生真菌TNF53 進(jìn)行分子鑒定及其抑菌活性研究。初步鑒定，TNF53為炭疽菌（Colletotrichum），該菌粗提物對三七絲核病菌、辣椒炭疽病菌、辣椒鐮刀病菌、水稻稻瘟病菌和白菜黑斑病菌均表現(xiàn)出抑菌活性，其中對三七絲核病菌的抑菌活性最明顯。以上結(jié)果表明該菌對植物病原真菌具有廣譜抗性。

關(guān)鍵詞：內(nèi)生真菌;分子鑒定;云南榧樹;抑菌活性

中圖分類號：S476.1文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2019）01-0134-04

Molecular Identification and Antibacterial

Activity of Endophytic Fungus TNF53 Isolated from Torreya yunnanensis

Sui Guoqiang?Ma Changle?2， Zhang Jinli?2， Li Bowen1， Li Jing?1

（1. Department of Life Sciences， Southwest Forestry University， Kunming650224， China;

2. College of Landscape Architecture， Southwest Forestry University， Kunming 650224， China）

Abstract?To identify the taxonomic status and antibacterial activity of TNF53 strain， the molecular identification and antibacterial activity of endophytic fungus TNF53 isolated from leaves of Yunnan eucalyptus were studied by kit method， filter paper diffusion method and sputum culture method. The TNF53 was initially identified as Colletotrichum. The crude extract of the strain showed antibacterial activity against Verticillium cinnabarium， Colletotrichum capsici， Fusarium solani， Magnaporthe grisea and Alternaria brassicae，especially against Verticillium cinnabarium. The above results indicated that the strain had broad-spectrum resistance to phytopathogenic fungi.

Keywords?Endophytic fungus; Molecular identification; Torreya yunnanensis; Antibacterial activity

植物內(nèi)生菌是指在一定階段或全部階段生活于健康植物各種組織和器官內(nèi)部或細(xì)胞間隙中[1-3]、不造成植物病害的真菌或細(xì)菌，其種類豐富多樣，且能與其宿主協(xié)同進(jìn)化[4-6]。近年來，隨著植物內(nèi)生菌新的代謝產(chǎn)物不斷被發(fā)現(xiàn)，以及越來越顯著的應(yīng)用價值，從植物中分離內(nèi)生菌用以防治植物病蟲害、人類疾病等已成為科技發(fā)展的一種趨勢[7，8]，目前研究的一大熱點就是從具有藥用價值的植物中分離內(nèi)生菌[9，10]。植物內(nèi)生菌可通過多種途徑發(fā)揮作用，有些能參與植物活性物質(zhì)的合成，有些能夠產(chǎn)生與宿主植物次生代謝產(chǎn)物相似或相同的物質(zhì)[11-13]。Stierle等[14]1993年從短葉紅豆杉（Taxus breviflia）中首次分離得到能合成抗癌物質(zhì)紫杉醇的內(nèi)生真菌;Stone[15]研究團(tuán)隊在2000年從澳大利亞北部當(dāng)?shù)鼐用癯Ｓ糜谥委熗鈧乃幱弥参锷咛伲↘enndia nigriscans）中分離得到1株新的內(nèi)生鏈霉菌，其能產(chǎn)生新的多肽類抗生素munumbicins A、B、C 和D，該發(fā)現(xiàn)掀起了從藥用植物中分離內(nèi)生菌的熱潮。目前，一些學(xué)者從榧樹中分離出多種能產(chǎn)生紫杉醇及其衍生物的內(nèi)生菌，但對這些內(nèi)生菌的生物活性及其用做生物藥物方面的研究較少[16-18]。

我國是一個農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)作物和林木的病害常大規(guī)模發(fā)生，有些患病作物可引起人畜中毒，使國家經(jīng)濟(jì)和人民生活遭受嚴(yán)重?fù)p失，而一些優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)品種往往因病害嚴(yán)重而被淘汰。目前主要防治手段仍是使用化學(xué)農(nóng)藥，由于農(nóng)藥的過多使用，導(dǎo)致3R（residue， resistence， resurgence）問題日益嚴(yán)重[19]。

因此，尋找具有抗菌活性的微生物資源，并將其用于防治植物病害及人類疾病具有非常重要的理論意義和實踐價值[20，21]。為此，本試驗對從云南榧樹葉片上分離得到的內(nèi)生真菌TNF53 進(jìn)行分子鑒定及其抑菌活性研究，為該菌的進(jìn)一步利用及其活性成分的分離鑒定奠定基礎(chǔ)，為以后農(nóng)林病害防治以及藥物的開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?供試材料

供試菌株：內(nèi)生真菌TNF53，由西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)教研室提供。

供試病原菌：辣椒炭疽病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、水稻稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）、小麥雪腐病菌（Typhula incarnate）、黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporium sp. Cucumebrium）、白菜黑斑病菌（Alternaria brassicae）、辣椒鐮刀?。‵usariuum solani）、三七絲核病菌（Verticillium cinnabarium）、梨黑星病菌（Venturia pyrina）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporium sp. Vasinfectum），均由西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)教研室提供。

培養(yǎng)基： PD培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基。

1.2?內(nèi)生真菌TNF53的分子鑒定

1.2.1?DNA提取?采用UNIQ-10柱式真菌基因組DNA提取試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）提取DNA。

1.2.2?PCR擴(kuò)增?采用核基因組ITS通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25 μL PCR反應(yīng)體系：2×power Taq PCR Master Mix 12.5 μL， DNA 1 μL，ITS1 0.75 μL，ITS4 0.75 μL，ddH2O 10 μL。擴(kuò)增程序：94℃ 5 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，30個循環(huán);72℃ 10 min。

將擴(kuò)增產(chǎn)物交上海生物技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。登錄NCBI，利用BLAST軟件將測序結(jié)果與GenBank中已知序列進(jìn)行比對，確定菌株所屬類群。

1.3?TNF53粗提物對9種病原菌的抑菌活性測定

采用濾紙片擴(kuò)散法[22]測定粗提物的抑菌活性。將倒置培養(yǎng)30 d的TNF53菌株連同培養(yǎng)基用消毒刀片劃成3 cm×3 cm大小的菌塊放置于250 mL錐形瓶內(nèi)，向錐形瓶內(nèi)倒入萃取液（乙酸乙酯∶甲醇∶冰醋酸=80%∶15%∶5%），提取9 d，每3 d換一次萃取液，將得到的萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，溶于4 mL甲醇，所得溶液即為內(nèi)生真菌TNF53菌株的次級代謝產(chǎn)物粗提物，于5 mL凍存管4℃冷藏柜中保存?zhèn)溆谩?0 μL粗提物緩慢滴加在直徑0.6 cm的滅菌濾紙片上，待其風(fēng)干后分別放置在含有9種不同病原菌孢子的PDA培養(yǎng)基中，滴加甲醇溶液的干燥濾紙片作為對照（CK），每組3個重復(fù)，將所有培養(yǎng)皿于25℃培養(yǎng)室倒置培養(yǎng)5 d。采用十字交叉法測定抑菌圈直徑并觀察抑菌圈透明度，對有抑菌效果的菌株在其抑菌圈最透亮?xí)r拍照，整理數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析。

1.4?內(nèi)生真菌TNF53與9種常見植物病原菌的對峙試驗

將內(nèi)生真菌TNF53和9種常見植物病原菌分別接種于PDA培養(yǎng)基中，于室溫條件下擴(kuò)大培養(yǎng)一周。采用對峙培養(yǎng)法[23]，在培養(yǎng)基同一半徑周圍用打孔器取直徑為6 mm的菌絲塊，同時接種于無菌PDA平板中，兩接種點相距40 mm左右，室溫培養(yǎng)。每組3次重復(fù)，記錄觀察內(nèi)生真菌TNF53與病原菌之間是否有拮抗作用。

2?結(jié)果與分析

2.1?內(nèi)生真菌TNF53的分子鑒定

采用試劑盒提取內(nèi)生真菌TNF53的DNA（圖1A），經(jīng)過PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物大小在600 bp左右（圖1B）。將測序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行比對，得出內(nèi)生真菌TNF53屬于炭疽菌屬（Colletotrichum）。

2.2?內(nèi)生真菌TNF53粗提物對9種常見植物病原菌的抑菌效果

由表1可知，內(nèi)生真菌TNF53的粗提物對三七絲核病菌、辣椒炭疽病菌、水稻稻瘟病菌、白菜黑斑病菌和辣椒鐮刀病菌5種植物病原菌有一定的抑制效果。其中對三七絲核病菌的抑制效果最明顯（圖2A），對辣椒鐮刀病菌（圖2B）和水稻稻瘟病抑制效果較弱，而對黃瓜枯萎病菌、小麥雪腐病菌、梨黑星病菌和棉花枯萎病菌未表現(xiàn)出明顯的抑菌活性。

2.3?植物內(nèi)生真菌TNF53與9種常見植物病原菌的對峙結(jié)果

從試驗結(jié)果可以看出，內(nèi)生真菌TNF53對白菜黑斑病菌、三七絲核病菌、水稻稻瘟病菌、辣椒鐮刀病菌和辣椒炭疽病菌有一定的拮抗作用（圖3）。與其他病原菌之間的拮抗效果不明顯。

3?討論與結(jié)論

經(jīng)分子鑒定得出TNF53屬于炭疽菌屬（Colletotrichum）真菌。內(nèi)生真菌TNF53的粗提物對水稻稻瘟病菌、辣椒炭疽病菌、辣椒鐮刀病菌、三七絲核病菌和白菜黑斑病菌有一定的抑制作用。其中對三七絲核病菌的抑制作用最明顯，對辣椒鐮刀病菌和水稻稻瘟病菌的抑制作用較弱;對黃瓜枯萎病菌、小麥雪腐病菌、梨黑星病菌和棉花枯萎病菌未表現(xiàn)出明顯的抑菌作用。

內(nèi)生真菌TNF53的粗提物對9株供試病原真菌表現(xiàn)出不同程度的活性，說明該菌的抑菌種類有一定的范圍，證明了該內(nèi)生真菌具有潛在的開發(fā)應(yīng)用價值，顯現(xiàn)出其作為生防菌的顯著優(yōu)勢和良好的應(yīng)用前景。但究竟是哪種物質(zhì)起作用，還需要進(jìn)一步研究。哈茨木霉菌的抑菌活性主要是幾丁質(zhì)酶發(fā)揮作用，通過克隆幾丁質(zhì)酶基因，可以得到大量的抑菌物質(zhì)[24]。對真菌TNF53的研究才剛剛開始，因此，對該菌的抗菌活性產(chǎn)物分離及結(jié)構(gòu)鑒定有待深入研究，進(jìn)而為構(gòu)建高效生防菌株奠定基礎(chǔ)。

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