甜菜堿對(duì)低溫脅迫下黃芩幼苗生理特性的影響

李小玲， 華智銳

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院， 陜西 商洛 726000)

黃芩(Scutellariabaicalensis)是我國(guó)優(yōu)質(zhì)的傳統(tǒng)藥材，唇形科屬，具有安胎止血、清熱解毒、瀉火燥濕等功效。黃連的抗菌效果在臨床應(yīng)用顯著，但黃芩比黃連的藥效更好，且不產(chǎn)生抗藥性，是一味防治農(nóng)業(yè)病害的理想草藥，也是開發(fā)潛力較大的藥用植物[1]。據(jù)史料記載，黃芩始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，臨床應(yīng)用已有2000多年的歷史，為商洛道地藥材，被列入秦嶺五大商藥之一[2]。近年來，隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化的不斷發(fā)展，全球范圍對(duì)黃芩的需求量日趨增長(zhǎng)，大自然中的黃芩不斷銳減，市場(chǎng)對(duì)該藥材的需求得不到及時(shí)補(bǔ)充。因此，人工栽培黃芩成為國(guó)內(nèi)對(duì)黃芩藥材需求的重要來源。然而當(dāng)下日漸惡劣的環(huán)境嚴(yán)重影響黃芩的產(chǎn)出、產(chǎn)量與質(zhì)量。商洛地處秦嶺山地，晝夜溫差較大，春季氣溫偏低，因此，在黃芩栽培中幼苗常會(huì)遭遇冷害，嚴(yán)重影響黃芩的生長(zhǎng)[3]。怎樣提高植物在低溫環(huán)境下的抗逆性并獲得較高產(chǎn)量是科研工作者長(zhǎng)期以來急需解決的問題。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，植物的生長(zhǎng)發(fā)育會(huì)受到逆境脅迫影響，其中主要制約植物產(chǎn)量和品質(zhì)的環(huán)境因子是低溫。植物體內(nèi)光合作用在低溫脅迫條件下受到抑制，損傷細(xì)胞膜，細(xì)胞老化死亡；細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解或變性；基因表達(dá)調(diào)控改變等[4]。當(dāng)外界影響引起的損傷超過植物本身的傷害時(shí)，植物將表現(xiàn)出冷害癥狀[5]。因此，探索解決黃芩生產(chǎn)中抗冷性的方法尤為重要。

甜菜堿(Glycine Betain,GB)是一種天然無毒的滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)，廣泛存在于植物、動(dòng)物、微生物體內(nèi)[6]。其作為植物體內(nèi)一種永久性或半永久性的滲透保護(hù)劑，在植物抗逆性中的研究中被廣泛關(guān)注[7]。在滲透脅迫下，甜菜堿的積累致使許多代謝關(guān)鍵酶保持原來的機(jī)能活性，進(jìn)而保持著細(xì)胞膜在低溫脅迫下的完整性，保證植株能夠正常生長(zhǎng)[8]。研究表明，一定濃度下的外源甜菜堿(GB)能提高逆境下植物的保護(hù)酶活性，降低丙二醛(MDA)的含量[9-11]，提高葉綠素含量[12]。作為藥用植物的黃芩，在已有的研究中主要集中在其種質(zhì)資源、生長(zhǎng)發(fā)育和育種方法等方面[13]。目前已有外源甜菜堿(GB)對(duì)低溫脅迫下香蕉幼苗[14]、黃瓜幼苗[15]、結(jié)縷草[16]、番茄幼苗[17]等生理特性的影響研究，但有關(guān)外源甜菜堿(GB)對(duì)黃芩生理特性在低溫脅迫下的研究未見報(bào)道。且外源甜菜堿在低溫脅迫下對(duì)植物的研究主要集中在作物、果樹、蔬菜等方面，而對(duì)藥用植物的研究還未見涉及。因此，筆者等以黃芩為試材，研究外源甜菜堿(GB)對(duì)黃芩低溫脅迫下生理特性的影響，旨在為利用甜菜堿緩解黃芩冷害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

商洛黃芩種子：由陜西商洛中藥材GAP研究和工程中心提供；外源甜菜堿(GB)，購(gòu)自西安晶博有限公司，含量≥99.5%，分析純?cè)噭〢R級(jí)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料預(yù)培養(yǎng) 選擇飽滿的黃芩種子于55℃溫水中浸泡15 min后撈出，平鋪放在培養(yǎng)皿(培養(yǎng)皿上平鋪一層濾紙，并濕潤(rùn))上后，放入恒溫箱中催芽。待80%左右的黃芩種子發(fā)芽時(shí)，播種于50孔穴盤中，放置于人工智能培養(yǎng)箱中育苗。選取長(zhǎng)勢(shì)良好的黃芩幼苗移栽至直徑15 cm左右的花盆中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，共移栽18盆，戶外常溫，期間定時(shí)澆水和松土。預(yù)培養(yǎng)30 d后選取生長(zhǎng)一致的幼苗用于試驗(yàn)。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)共設(shè)2個(gè)對(duì)照和4個(gè)處理。CK1：蒸餾水+常溫處理，CK2：蒸餾水+低溫處理(4℃)。 根據(jù)外源甜菜堿(GB)的濃度設(shè)4個(gè)處理。T1:0.300 g/L GB，T2:0.600 g/L GB，T3:0.900 g/L GB，T4:1.200 g/L GB。按照以上對(duì)照和4個(gè)處理，采用不同濃度GB噴施黃芩幼苗葉片，正反面葉片均噴濕。各濃度3次重復(fù)，每次重復(fù)3株苗，每2 d噴灑1次。處理7 d后，分別選取長(zhǎng)勢(shì)良好的植株放入恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行4℃低溫處理3 d，植株取出后，立即剪下適宜的葉片，洗凈，用蒸餾水沖洗，取出主葉脈后，剪碎。用于測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、葉綠素含量、過氧化物酶(POD)、可溶性蛋白的含量、丙二醛(MDA)含量和相對(duì)電導(dǎo)率等生理指標(biāo)。

1.2.3 各項(xiàng)生理指標(biāo)的測(cè)定 MDA含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[18]的硫代巴比妥酸法；SOD活性的測(cè)定參照文獻(xiàn)[19]氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法；POD活性的測(cè)定參照文獻(xiàn)[20]的愈創(chuàng)木酚顯色法；CAT活性測(cè)定參照文獻(xiàn)[21]紫外光譜法；質(zhì)膜透性的測(cè)定參照文獻(xiàn)[21]的相對(duì)電導(dǎo)率法；可溶性蛋白含量的測(cè)定參照高文獻(xiàn)[21]的考馬斯亮藍(lán)G-250法；葉綠素含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[22]丙酮-碳酸鈣法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有處理每次測(cè)定3次重復(fù)，數(shù)據(jù)為3次測(cè)定值的平均值，用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS軟件，差異顯著性用Duncan法檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜堿對(duì)低溫脅迫下黃芩幼苗葉綠素含量的影響

由圖1可知，黃芩幼苗葉綠素的含量CK2較CK1低1.698 mg/g，且差異顯著，說明低溫脅迫降低了黃芩幼苗葉片中葉綠素的含量。當(dāng)葉面噴施不同濃度GB后，與CK2相比，不同濃度GB處理的葉綠素含量都有不同程度的提高，且隨著GB濃度的升高呈先升后降趨勢(shì)，且T2處理的黃芩幼苗葉綠素含量最高，為3.189 mg/g，較CK2增加66%。由此可知，適宜濃度甜菜堿可提高黃芩在低溫脅迫下的葉綠素含量，緩解低溫的冷害作用，且噴灑0.6 g/L的甜菜堿效果最佳。

注：圖中不同小寫字母表示處理間在0.05水平差異顯著，下同。Note: Different lowercase letters indicate significance of difference at P<0.05 level. The same below.

2.2 甜菜堿對(duì)低溫脅迫下黃芩幼苗丙二醛含量的影響

由圖2可知，黃芩幼苗葉片丙二醛(MDA)的含量CK2較CK1高9.105 mmol/g，差異顯著。且CK2的黃芩幼苗葉片MDA最高，說明低溫脅迫加劇了膜脂過氧化作用，引起了大量過氧化產(chǎn)物MDA的積累。當(dāng)施用不同濃度GB處理后，黃芩幼苗葉片的MDA含量都有不同程度的降低，說明噴施GB能明顯抑制MDA生成，且隨著GB濃度的升高M(jìn)DA含量呈先降后升的趨勢(shì)，T2處理黃芩幼苗葉片的MDA含量最低，與CK2相比降低56%，抑制效果最強(qiáng)。表明，施用甜菜堿可提高黃芩在低溫脅迫下的MDA含量，且T2處理(濃度為0.6 g/L的甜菜堿)對(duì)黃芩受到低溫脅迫影響最小，能有效提高黃芩幼苗的抗逆性。

圖2 低溫脅迫下不同濃度甜菜堿處理黃芩幼苗的MDA含量Fig.2 Leaf MDA content of S. baicalensis seedlings sprayed with different concentration of glycine betaine under low temperature stress

2.3 甜菜堿對(duì)低溫脅迫下黃芩幼苗SOD、POD和CAT酶活性的影響

由圖3可知，CK2與CK1相比，黃芩幼苗葉片中SOD、POD、CAT的活性明顯降低，分別降低70.13 U/mg、41.97 U/g·min、6.832 U/g·min，且差異顯著，說明低溫使植株體內(nèi)酶的活性大大降低。當(dāng)施用不同濃度GB處理后，三種酶活力都有不同程度的提升。T1～T4處理后的SOD活力較CK2分別提升了43.23%、50.24%、35.75%和15.38%，且均與CK2差異顯著，其中噴施GB為0.6 g/L時(shí)效果最佳； T2處理的POD活性最高，比CK2增加26.49 U/(g·min)；由圖3還可知，低溫脅迫下黃芩幼苗葉片中CAT活性先急劇下降，經(jīng)葉面噴施了不同濃度的外源GB后，CAT活性的變化趨勢(shì)和SOD、POD趨勢(shì)基本相同，都有不同程度的提升，總體呈先升后降趨勢(shì)。T2處理的CAT活性最高，為9.358 U/(g·min)，較CK2的3.916 U/(g·min)提高136%。綜上所述，噴施GB能夠在低溫脅迫下提高黃芩幼苗的SOD、POD、CAT酶活力，且效果顯著，以T2處理(濃度為0.6 g/L的甜菜堿)效果最佳。

圖3 低溫脅迫下不同濃度甜菜堿處理黃芩幼苗的SOD、POD和CAT活性Fig.3 Leaf SOD, POD and CAT activity of S. baicalensis seedlings sprayed with different concentration of glycine betaine under low temperature stress

2.4 甜菜堿對(duì)低溫脅迫下黃芩幼苗可溶性蛋白含量的影響

由圖4可知，黃芩幼苗可溶性蛋白含量CK2較CK1降低63.717 mg/g，差異顯著，說明低溫可使黃芩幼苗的可溶性蛋白含量大大降低。CK2的黃芩幼苗可溶性蛋白含量最低。當(dāng)施用不同濃度GB處理后黃芩幼苗的可溶性蛋白含量都有不同程度的提升，隨著GB濃度的升高，可溶性蛋白含量呈先升后降趨勢(shì)，且與對(duì)照(CK1、CK2)差異明顯。T2處理的可溶性蛋白含量最高，為64.146 mg/g，與CK2相比提升178%，說明T2處理(濃度為0.6 g/L的甜菜堿)能顯著提升可溶性蛋白的含量。表明，施用甜菜堿可提高可溶性蛋白的含量，能有效提高黃芩幼苗的抗逆性。

2.5 甜菜堿對(duì)低溫脅迫下黃芩幼苗質(zhì)膜透性的影響

由圖5可知，黃芩幼苗葉片中電導(dǎo)率CK2較CK1顯著增加，差異顯著，說明低溫脅迫導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)破壞，膜透性增大，細(xì)胞內(nèi)容物外滲。CK2與CK1相比，CK2的相對(duì)電導(dǎo)率顯著增大，比CK1提高154%，說明低溫脅迫下質(zhì)膜透性顯著增大。噴施不同濃度GB后，T1～T4處理的相對(duì)電導(dǎo)率均有所下降，且隨著GB濃度的生高，呈先降后升趨勢(shì)， T2處理最小，比CK2下降50%左右。表明，噴施GB能明顯緩解低溫脅迫的迫害。

圖4低溫脅迫下不同濃度甜菜堿處理黃芩幼苗可溶性蛋白的含量
Fig.4 Leaf soluble protein content ofS.baicalensisseedlings sprayed with different concentration of glycine betaine under low temperature stress

圖5 低溫脅迫下不同濃度甜菜堿處理黃芩幼苗的相對(duì)電導(dǎo)率Fig.5 Leaf relative conductance rate of S. baicalensis seedlings sprayed with different concentration of glycine betaine under low temperature stress

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

試驗(yàn)表明，外源甜菜堿可提高黃芩幼苗在低溫脅迫下的抗冷能力，適宜濃度的甜菜堿能提高葉綠素含量，促進(jìn)光合作用；可抑制丙二醛的含量和相對(duì)電導(dǎo)率的提高，增加植物細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的活性和抗氧化物質(zhì)的積累，穩(wěn)定了細(xì)胞膜，繼而維持黃芩幼苗的抗冷性。

不同濃度甜菜堿對(duì)低溫脅迫下黃芩幼苗抗寒能力的影響各不相同，但在濃度為0.6 g/L時(shí)，與低溫蒸餾水對(duì)照相比，黃芩幼苗葉片SOD、POD和CAT活性提高1.502倍、2.031倍和2.362倍；總?cè)~綠素含量提高68%；可溶性蛋白含量高于對(duì)照178%；相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量達(dá)到最低，分別下降50%和56%。綜合各項(xiàng)指標(biāo)表明，GB濃度為0.6 g/L時(shí)能明顯緩解低溫脅迫的傷害。

3.2 討論

大量的研究證明，低溫脅迫引起植物的冷害作用是由于植物體內(nèi)活性氧的積累和酶活性下降所造成的[23]，而甜菜堿作為一種天然無毒的滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)，除了調(diào)節(jié)植物細(xì)胞的滲透勢(shì)、維持正常的代謝，還可以提高生物大分子的功能與結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，是一類理想的逆境調(diào)節(jié)物質(zhì)[24]。適宜濃度的甜菜堿可降低膜脂過氧化產(chǎn)生的丙二醛，提高植物體內(nèi)的保護(hù)酶活性及葉綠素相對(duì)含量，有效促進(jìn)植物光合作用及干物質(zhì)堆積，從而緩解逆境條件對(duì)植物的傷害[25]。

光合作用的強(qiáng)弱與植物本身的葉綠素含量息息相關(guān)，植物葉綠素含量下降是植物受到逆境脅迫時(shí)的重要特征[26]。衛(wèi)丹丹[17]認(rèn)為，低溫直接影響葉綠素含量、葉綠體類囊體膜的組分、葉綠素亞顯微結(jié)構(gòu)等光合系統(tǒng)的活性和結(jié)構(gòu)。試驗(yàn)中，低溫脅迫后黃芩幼苗葉片中葉綠素含量顯著下降，說明低溫脅迫會(huì)對(duì)植物光合器官造成傷害。經(jīng)過甜菜堿的不同濃度處理后，葉綠素含量均有不同程度的提高，且噴施0.6 g/L GB效果最佳，能明顯促進(jìn)葉綠素的合成，進(jìn)而提高葉片光合活性。

膜脂過氧化作用中，丙二醛作為最重要的產(chǎn)物，通過檢測(cè)丙二醛的含量，能認(rèn)識(shí)到膜脂過氧化的大小范圍，繼而間接測(cè)定出植物膜系統(tǒng)受傷程度和抗逆性的強(qiáng)弱。所以低溫脅迫下MDA含量的高低可以反映黃芩幼苗葉片生物膜受傷害的程度及其抗冷害的強(qiáng)弱。試驗(yàn)表明，低溫脅迫下，MDA含量遠(yuǎn)高于常溫正常生長(zhǎng)的黃芩幼苗，噴施不同濃度甜菜堿后黃芩幼苗MDA含量均低于蒸餾水+低溫(4℃)處理，說明甜菜堿可緩解膜脂過氧化的過程，降低丙二醛的含量，促進(jìn)植株的正常生長(zhǎng)；且噴施0.6 g/L GB能明顯緩解低溫脅迫的危害。

SOD、POD、CAT是植物體內(nèi)的保護(hù)酶。提高保護(hù)酶的活性有利于在低溫脅迫下清除大量的活性氧自由基，減少自由基對(duì)細(xì)胞造成的大分子活性物質(zhì)的侵害和質(zhì)膜脂化，從而維持植株各個(gè)細(xì)胞的正常生命活動(dòng)[27]。試驗(yàn)表明，在低溫脅迫下，施加不同濃度的甜菜堿后，3種保護(hù)酶的活性都有不同程度的提高，但都低于常溫對(duì)照，說明低溫影響著保護(hù)酶的活性。且以0.6 g/L甜菜堿處理時(shí)酶活性提高最大，說明0.6 g/L的甜菜堿能夠大幅度提高黃芩幼苗在低溫脅迫下的生長(zhǎng)指數(shù)。

植物抗冷性的增強(qiáng)與蛋白質(zhì)的合成相關(guān)，可溶性蛋白主要起到的作用是維持滲透調(diào)節(jié)和防止細(xì)胞脫水，其含量的增加會(huì)提高細(xì)胞自身束縛水的含量，從而減少植物脫水的現(xiàn)象的發(fā)生[28]。試驗(yàn)表明，在低溫脅迫下，黃芩幼苗可溶性蛋白含量大幅度降低，而甜菜堿能夠提高黃芩幼苗的可溶性蛋白含量，且在濃度0.6 g/L時(shí)，可溶性蛋白含量提高最大，比CK2提高178%。

細(xì)胞膜透性大小可通過測(cè)量其相對(duì)電導(dǎo)率來體現(xiàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，在低溫脅迫下，黃芩幼苗的相對(duì)電導(dǎo)率大幅度增加，經(jīng)甜菜堿不同濃度處理后，均可顯著降低黃芩幼苗的相對(duì)電導(dǎo)率；且噴施0.6 g/L GB效果最佳。這可能是由于甜菜堿可以穩(wěn)定細(xì)胞膜上的大分子的結(jié)構(gòu)，保持了酶活性，從而穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)。

試驗(yàn)結(jié)果為黃芩的耐低溫性研究提供了參考，也為利用甜菜堿作為化控措施以緩解黃芩冷害提供了理論依據(jù)。雖然本研究探討了甜菜堿在低溫脅迫下對(duì)黃芩幼苗生理特性的影響，但僅是圍繞盆栽試驗(yàn)開展研究，而對(duì)于研究黃芩的大田栽培試驗(yàn)中相關(guān)生理生化指標(biāo)還有待繼續(xù)探討。