豬流行性腹瀉病毒云南流行毒株分離與鑒定

孫顯國， 畢峻龍,2， 趙 謙， 藍 睿， 左慶威， 楊貴樹， 尹革芬*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院, 云南 昆明 650201； 2.楚雄州動物疫病預(yù)防控制中心， 云南 楚雄 675000)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea, PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcineepidemic diarrhea virus, PEDV)引起豬的一種急性、高度傳染性腸道疾病，多冬季爆發(fā)。近年來，在比利時、日本、墨西哥、加拿大、泰國等多個國家和中國多個地區(qū)均報道了該病的流行。PEDV的發(fā)生給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失，雖然疫苗的應(yīng)用有效地控制了該病發(fā)生，但直至目前該疫情在云南地區(qū)仍有不同程度的流行[1]。

PEDV屬于冠狀病毒，病毒粒子核酸為線性單股正鏈RNA，基因組核酸具有感染性，病毒基因組在胞漿中進行復(fù)制。主要的結(jié)構(gòu)蛋白有纖突蛋白(Spike,S)、膜蛋白(Membrane,M)、核衣殼蛋白(Nucleocapsid,N)和小膜蛋白(small Membrane,E)[1]。S蛋白是位于病毒粒子表面的糖基化纖突蛋白[2]，S基因編碼分子量20～32 kDa，由1 383個氨基酸組成[3]。S基因是PEDV基因組中最可變的基因之一，目前在我國流行的PEDV毒株S基因具有特征性變異，根據(jù)這一特征性變異可區(qū)分流行毒株和經(jīng)典毒株，并為疫苗的選擇提供理論依據(jù)[4]。2016年冬季以來，流行性腹瀉在云南省多個豬場暴發(fā)流行并呈現(xiàn)新的流行特征，接種過豬流行性腹瀉疫苗的豬也未能幸免，高發(fā)病率和高致死率給豬場造成重大的經(jīng)濟損失。針對當前流行的豬流行性腹瀉，試驗從云南某豬場采集了20份仔豬腹瀉糞便樣品進行檢測，對陽性樣品進行病毒分離和對PEDV S基因的克隆測序分析，以便于進一步了解和掌握PEDV在云南省的流行狀況，有助于控制和預(yù)防PED，并為新疫苗的開發(fā)和疫苗的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

20份仔豬腹瀉糞便樣品于2017年5月采自云南某豬場。

1.2 樣品處理

將RT-PCR檢測出的陽性樣品經(jīng)處理后加入M199培養(yǎng)基及雙抗(青鏈霉素)4℃過夜，次日于4℃ 10 000 r/min離心10 min取上清液，上清液用0.22 μm的過濾膜過濾后分裝，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑

細胞株：Vero細胞(非洲綠猴腎細胞)，購于中國科學(xué)院昆明細胞庫；M199、胎牛血清(fetal bovine se,FBS)、青霉素-鏈霉素雙抗、0.25%胰酶購于gibco公司；核酸提取及PCR及qPCR相關(guān)試劑試劑：RNAiso Plus購于大連寶生物公司；qPCR：IScriptTM cDNA Synthesis Kit、反轉(zhuǎn)錄試劑：SsoFastTM EvaGreen Supermix購于BIO-RAD公司；IFA試劑：多聚甲醛、Triton X-100、脫脂奶粉、DAPI等購于上海碧云天公司；抗淬滅劑購于invitrogen公司；鼠源抗豬PEDV單抗購于美國vmrd公司(貨號：S1D12);FITC標記的羊抗鼠二抗購至invitrogen公司(貨號：A11001)，pMD18-T 及 T4 Linkase 均購自 TaKaRa 公司。

1.4 樣品檢測

按照RNA提取試劑盒提取樣品中總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA。以總RNA為模板利用引物對樣品進行PEDV的RT-PCR 檢測(表1)，產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 PEDV擴增引物序列Table 1 PEDV amplification primer sequences

1.5 病毒的初步分離

選取PEDV RT-PCR檢測陽性樣品作為分離病毒的病料。將處理過的陽性病料懸液，接種至6孔細胞培養(yǎng)板中已長滿的單層Vero細胞，同時按30 ng/mL濃度添加胰酶，置于37℃ 5%CO2感染作用1.5 h，1.5 h后棄去其中的液體，再加入含10 ng/mL濃度胰酶的M199培養(yǎng)基至3 mL，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)，逐日觀察并記錄細胞的變化情況。如果4～5 d仍無病變，收毒，凍融3次，將上代細胞培養(yǎng)物按上述方法繼續(xù)傳代，每代細胞盲傳物均用RT-qPCR檢測病毒載量。

1.6 間接免疫熒光(IFA)鑒定病毒

預(yù)先將Vero 細胞在96孔細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，待細胞長至80%左右時開始接毒。每孔保證病毒液100 μL，37℃感染作用1.5 h后將培養(yǎng)基換成含胰酶的M199 培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。同時，設(shè)立試驗組(接毒組)和對照組(不接毒)。接毒48 h后對病毒進行IFA 鑒定，在熒光倒置顯微鏡下觀察檢測結(jié)果。

1.7 病毒感染力的滴定

Vero細胞在96孔細胞培養(yǎng)板中正常培養(yǎng)，待細胞長至80%左右時開始接毒。將毒力穩(wěn)定的第15代病毒進行連續(xù)10倍稀釋，從10-1～10-10。吸取每一稀釋度的病毒液100 μL，加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，每一稀釋梯度的病毒液接種6個細胞孔，37℃感染作用1.5 h后將培養(yǎng)基換成含30 ng/mL胰酶的M199培養(yǎng)基，置于37℃ 5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。逐日觀察細胞病變(CPE)情況，直至終點，用Reed-Muench兩氏法計算TCID50。

1.8 病毒S基因的遺傳進化分析

分別以流行性腹瀉經(jīng)典毒株CV777(AF353511)和流行毒株CH-CCC(KT388421)為參考模板，利用Primer 3.0設(shè)計S基因引物(表1)并進行RT-PCR擴增，然后對S基因進行分子克隆和測序。將測序結(jié)果用DNAstar軟件對序列進行拼接分析比較，利用MEGA 7.0對從GenBank中下載的參考株S基因序列作同源性和系統(tǒng)進化分析，參考株信息見表2。

表2 PEDV參考毒株Table 2 PEDV reference strains

2 結(jié)果與分析

2.1 送檢樣品RT-PCR檢測

從圖1可知，在糞便樣品中擴增出429 bp片段，與預(yù)期目的片段長度一致，提示豬群中存在PEDV感染。

2.2 病毒分離

從表3可知，第一代細胞培養(yǎng)物RT-PCR的CT值為21.09，病毒含量較少，直到第十五代細胞培養(yǎng)物RT-PCR的CT值為12.14，往后代次的細胞培養(yǎng)物CT值穩(wěn)定在11.32左右，提示病毒在細胞上已經(jīng)能夠穩(wěn)定生長，結(jié)果提示已初步分離獲得PEDV。此外，細胞盲傳至15代時出現(xiàn)了典型的細胞病變(CPE)：細胞圓縮、聚集，最后細胞發(fā)生裂解(圖2)。

注：MDL-1000 Marker;1：PEDV陰性對照電泳結(jié)果;2: PEDV陽性對照電泳結(jié)果; 3～11：PEDV陽性樣品電泳結(jié)果。Note: MDL-1000 Marker; 1, Electrophoresis results of PEDV negative CK; 2, Electrophoresis results of PEDV positive CK; 3-11, Electrophoresis results of PEDV negative sample.

表3 RT-qPCR檢測各代細胞培養(yǎng)物的病毒載量Table 3 Viral load of cell cultures from each generation by RT-qPCR

圖2 第15代分離病毒接種Vero細胞24 h后的CPEFig.2 CPE of Vero cells inoculated with virus isolated from the fifteenth generation 24 h later

2.3 病毒IFA鑒定

將第18代的分離毒接種于Vero細胞，48 h后進行間接免疫熒光檢測。結(jié)果表明，分離毒株能與商品化的PEDV單抗發(fā)生陽性反應(yīng)，出現(xiàn)特異性綠色熒光(圖3)，進一步證明所分離病毒為PEDV，命名為YNDH-2017株。

2.4 PEDV YNDH-2017株感染力滴定

逐日觀察細胞生長狀態(tài)，記錄細胞病變情況，細胞CPE變化主要有細胞圓縮，聚集。隨著病毒濃度的降低，細胞CPE程度逐漸減弱(圖4)，病毒稀釋了10-6～10-7倍以后進行細胞接毒，細胞無CPE。用Reed-Muench兩氏法計算得分離株的TCID50為10-4.85/0.1 mL。

圖3 分離病毒的間接免疫熒光檢測Fig.3 Indirect immunofluorescence assay of the isolated viruses

圖4 不同濃度病毒接種Vero細胞24 h后的CPEFig.4 CPE of Vero cells inoculated with virus with different concentration 24 h later

2.5 PEDV YNDH-2017株S基因全序列的擴增

從圖5可知，電泳結(jié)果同預(yù)期目的片段588 bp、984 bp、1 000 bp、1 064 bp和1 075 bp大小相符。擴增片段進行克隆測序后，將獲得的S基因片段用DNAstar軟件對序列進行拼接分析比較，經(jīng)測序拼接結(jié)果表明該基因全長為4 158 bp，編碼1 386個氨基酸。將YNDH-2017與國內(nèi)外參考毒株同源性比較發(fā)現(xiàn)，與經(jīng)典毒株CH-S株和疫苗CV777株的同源性為92.8%和93.1%，與日本83P-5株同源性為93.4%，與美國colorado-2013同源性為98%，與云南的YN144(KT012232)株和YN1(KT012227)株同源性分別為97.9%和98.1%，與流行毒株CH-CCC株同源性為98.2%(圖6)，表明成功獲得PEDV YNDH-2017 S基因全序列。

注：MDL-2000，標記物； 1-5, S1-S5基因的電泳結(jié)果。Note:MDL-2000, Marker; 1-5, Electrophoresis results of PEDV S1-S5 genes.

注：黑色框為試驗分離毒株。Note: The strain within a black frame represents the test isolated strain.

2.6 PEDV YNDH-2017株S基因進化樹

從圖7可知，分離獲得的YNDH-2017株S基因與目前國內(nèi)流行PEDV分離株CH-CCC和云南省流行YN-1株和YN144株在同一分支上，親緣關(guān)系較近；而與經(jīng)典疫苗毒株CV777株在兩個大的分支上，親緣關(guān)系較遠。表明，云南省分離株YNDH-2017株與目前國內(nèi)流行的PEDV毒株有較近親緣性。

注：黑色框為試驗分離毒株。
Note: The strain within a black frame represents the test isolated strain.

圖7YNDH-2017分離株S基因進化樹
Fig.7 Phylogenetic tree of S gene from YNDH-2017 strain

2.7 PEDV YNDH-2017株S基因氨基酸位點變異分析

擴增獲得的PEDV YNDH-2017株S基因全長為4 158 bp，編碼1 386個氨基酸，與疫苗毒株CV777相比，試驗分離的毒株YNDH-2017在氨基酸59～62 位連續(xù)性插入4個氨基酸，氨基酸140位缺失1個氨基酸，在氨基酸163～164 位連續(xù)性缺失2個氨基酸(圖8)。以上氨基酸的變異與近年我國地方流行毒株變化趨勢一致。

注：圖中虛線部分代表氨基酸缺失和插入位置，黑色框代表試驗分離病毒株。Note: The broken line represents the location of amino acid deletion and insertion. The strain within a black frame represents the test isolated strain.

3 結(jié)論與討論

PEDV是危害養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的主要腸道病毒之一。近年來，國內(nèi)外不少學(xué)者對PEDV 感染情況進行了研究，并認為PEDV在不斷地發(fā)生變異。因此，為確定2017 年云南某豬場發(fā)生仔豬腹瀉疫情的病原，利用RT-PCR檢測PEDV，并把所得陽性樣品進行處理后，利用Vero 細胞進行分離培養(yǎng)，通過IFA試驗鑒定，確定所獲得的毒株為PEDV毒株，命名為YNDH -2017。相比于其他冠狀病毒，豬流行性腹瀉病毒的細胞培養(yǎng)相對比較困難。直到1982年宣華[3]等將分離到的毒株在胎豬腸組織原代單層細胞內(nèi)培養(yǎng)才取得成功。1988年瑞士的HOFMANN[4]首次報道了在細胞培養(yǎng)液中加入適量胰酶，病毒可在Vero細胞上傳代培養(yǎng)，這是因為豬流行性腹瀉病毒具有依賴胰酶的特性，在胰酶的激活作用下，豬流行性腹瀉病毒的病毒粒子會釋放出來并發(fā)揮作用。因此，在沒有胰酶的條件下，PEDV在細胞中進行傳代比較困難[5]。試驗中，將分離的PEDV毒株在添加適當胰酶濃度的Vero細胞上盲傳至15代可觀察到典型的細胞病變，細胞形成圓縮，聚集，最后細胞發(fā)生裂解[6]，提示PEDV已經(jīng)在Vero細胞上增殖，將第15代的分離毒株接種于Vero細胞，48 h后進行間接免疫熒光檢測，分離毒株能與商品化的PEDV單抗發(fā)生反應(yīng)，出現(xiàn)特異性綠色熒光[7]，進一步證實了在Vero細胞上成功分離到PEDV；并且在Vero細胞上培養(yǎng)至72 h細胞病變達80%以上，隨著病毒在細胞上的傳代次數(shù)的增加，病毒對細胞的適應(yīng)性也隨之增強，病毒滴度也相應(yīng)升高[8]，TCID50為10-4.85/0.1 mL。

PEDV的結(jié)構(gòu)基因中，S基因編碼的S蛋白是位于病毒粒子表面的纖突糖蛋白，在病毒侵入宿主細胞時，識別靶細胞受體，使病毒與細胞膜融合[9]；此外，PEDV的主要中和抗原表位和受體結(jié)合域位于S蛋白區(qū)，因此S蛋白是研發(fā)PEDV疫苗的首要目標蛋白[6,10]。有研究報道，通過對中國南方地區(qū)PEDV毒株的S基因進行測序分析發(fā)現(xiàn)，這些毒株與泰國毒株親緣關(guān)系較近，但與經(jīng)典疫苗毒株CV777株及國內(nèi)早期毒株存在較大差異[11]。S基因是PEDV最容易發(fā)生變異的基因，S基因的氨基酸存在著典型的缺失和插入模式，被認為是區(qū)別經(jīng)典毒株和流行毒株的分子標記[12]，所以根據(jù)S基因變異情況能在一定程度上反映出不同PEDV 株的遺傳變異情況及親緣關(guān)系[13-14]。試驗對云南省分離的YNDH-2017株進行S基因同源性比較，分離的YNDH-2017株與經(jīng)典毒株CH-S株和疫苗毒株CV777株的同源性為92.8%和93.1%，與日本經(jīng)典83P-5株同源性為93.4%，與美國colorado-2013同源性為98%，與云南的YN144(KT012232)株和YN1(KT012227)株同源性為97.9%和98.1%，與流行毒株CH-CCC株同源性為98.2%。與國內(nèi)外參考毒株S基因比較并繪制進化樹，結(jié)果顯示分離獲得的YNDH-2017株S基因與目前國內(nèi)流行的PEDV分離株親緣關(guān)系較近，與云南省流行毒株YN1株，YN144株和CH-CCC株在同一分支，說明分離株 YNDH-2017株是目前國內(nèi)流行的PEDV毒株。分離毒株YNDH-2017株S基因序列與經(jīng)典疫苗毒株CV777株和流行毒株CH-CCC株比對，結(jié)果顯示與早期病毒株CV777和CH/S等相比YNDH-2017株在氨基酸59～62位存在59QGVN624個氨基酸的插入，在氨基酸140位存在140N 1個氨基酸的缺失，在氨基酸163～164 位存在163NI1642個氨基酸的缺失，這一突變特征與當前已報道的一些新的流行病毒株的突變特征一致，進一步說明試驗分離得到的YNDH-2017株是目前流行的PEDV毒株，為更好的了解和掌握PEDV在云南的流行狀況和對PED疫苗的選擇提供理論參考。