霍山石斛莖的食用安全性評價

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(1.合肥工業(yè)大學食品與生物工程學院,安徽合肥 230009;2.霍山縣天下澤雨生物科技發(fā)展有限公司,安徽六安 237266)

霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC. Z. Tang et S. J. Cheng)俗稱米斛,為蘭科多年生草本植物,主產于大別山區(qū)的安徽省霍山縣及周邊地區(qū),其莖作為食用部位具有悠久的歷史[1]?，F(xiàn)代研究表明,霍山石斛莖不僅含有氨基酸、維生素、蛋白質等多種營養(yǎng)成分,還富含多糖、類黃酮、多酚等活性因子[2-3],具有增強機體免疫力、抗氧化、抗腫瘤、降血糖等諸多功能[4-5]。

近年來,隨著人們生活水平的提高和霍山石斛人工栽培規(guī)模的擴大,霍山石斛作為食品原料的應用范圍越來越廣,但其食用安全性尚未得到國家認定,因此嚴重制約了霍山石斛作為食品原料使用的產業(yè)發(fā)展。李濱等[6]曾對霍山石斛進行了急性毒性、亞急性毒性和遺傳毒性評價,但該研究未明確霍山石斛的受試部位。

為了準確評價霍山石斛常見食用部位的安全性,本文依據(jù)《新食品原料申報與受理規(guī)定》,以霍山石斛莖(DHS)為受試原料進行了急性毒性、遺傳毒性、基于90 d動物喂養(yǎng)試驗的亞慢性毒性和致畸作用的評價,以期為霍山石斛莖作為新食品原料使用提供更加全面的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

霍山石斛莖 霍山縣天下澤雨生物科技發(fā)展有限公司;SPF級Wistar斷乳大鼠145只(70±10 g)、SPF級昆明小鼠95只(20±2 g) 山東大學實驗動物中心,實驗動物生產許可證號:SCXK(魯)20130009,實驗動物使用許可證號,SYXK(魯)20100011,實驗動物飼料生產許可證號:SCXK(京)2014-0008;鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102菌株 中國軍事醫(yī)學科學院;氯化鈉、氯化鉀、環(huán)磷酰胺、敵克松其等試劑 均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

DGF30/7-I電熱鼓風干燥箱 南京實驗儀器廠;CA-800全自動血細胞計數(shù)儀 日本埃爾瑪CIS公司;RM2235石蠟切片機 德國萊卡公司;CT15RT高速冷凍離心機 上海天美科學儀器有限公司;TS100倒置顯微鏡 日本NIKON公司;SW-CJ-1FD超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司。

1.2 實驗方法

所有動物試驗均依據(jù)2003版《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》在山東大學完成。

1.2.1 小鼠急性毒性試驗 采用最大耐受劑量法(MTD)進行試驗。選取健康昆明小鼠20只,雌雄各半。精密稱定10 g霍山石斛莖干燥粉末,加入適量蒸餾水混勻,并定容至60 mL。將小鼠禁食16 h后,以0.30 mL/10 g·bw的劑量給小鼠灌胃3次,每次間隔4 h,即總劑量為15.0 g/kg·bw。在正常飲食的條件下連續(xù)觀察14 d,并記錄小鼠的中毒表現(xiàn)和死亡情況,觀察期后將受試動物解剖,檢查肝臟、脾臟、腎臟、心臟、肺、胃、腸等主要器官的變化。

1.2.2 遺傳毒性試驗

1.2.2.1 Ames試驗 選取健康雄性成年Wistar大鼠5只(體重(70±10) g),適應性培養(yǎng)后按500 mg/kg·bw劑量一次腹腔注射200 g/L的多氯聯(lián)苯溶液(玉米油),繼續(xù)飼養(yǎng)5 d,禁食12 h后處死大鼠,于超凈工作臺內取出大鼠肝臟并稱重,用冰冷的0.1 mol/L KCl溶液連續(xù)沖洗以除去血紅蛋白,加入0.1 mol/L KCl溶液適量,剪碎、勻漿、離心后,取上清液作為S9組分,備用。試驗菌株為經鑒定符合要求的鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型菌株TA97、TA98、TA100、TA102。稱取1.25 g霍山石斛莖干燥粉末樣品,用蒸餾水混勻并定容至25 mL,配制成50000 μg/mL的樣品原液,滅菌,用無菌雙蒸水依次稀釋至:50000、10000、2000、400、80 μg/mL。在已融化并于45 ℃水浴保溫的瓊脂中依次加入0.1 mL試驗菌液(2×109個/mL)、0.1 mL樣品溶液、0.5 mL S9混合液,混勻后迅速倒入制備好的底層培養(yǎng)基上,平放固化。同時設自發(fā)回變組、溶劑對照組和陽性對照組,每組3個平行。其中自發(fā)回變組不做其他處理;溶劑對照組加入同體積雙蒸水;不加S9混合液時,加入同體積敵克松作為TA97、TA98、TA102的陽性對照,疊氮鈉為TA100的陽性對照;加S9混合液時,加入同體積2-氨基芴為TA97、TA98、TA100的陽性對照,1,8-二羥蒽酮為TA102的陽性對照。將上述平皿置于37 ℃下培養(yǎng)48 h,統(tǒng)計每皿回變菌落數(shù),整套實驗在相同條件下重復兩次。

1.2.2.2 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗 取SPF級雌雄各半的昆明小鼠50只,隨機分成5組,每組10只,即受試物劑量低、中、高劑量組(1.667、3.333、6.667 g/kg·bw),同時設蒸餾水為陰性對照組、40 mg/kg·bw的環(huán)磷酰胺(CP)為陽性對照組,灌胃體積為0.40 mL/10 g·bw。兩次給予受試物,每次間隔24 h,末次給予受試物6 h后處死小鼠,取胸骨或股骨,擠出骨髓液并與小牛血清混勻,涂片,自然干燥,甲醇固定、Giemsa染色、磷酸鹽緩沖液(pH6.8)沖洗晾干,光學顯微鏡下檢查。每只小鼠計數(shù)1000個嗜多染紅細胞(PCE),記錄含微核的細胞數(shù),并計算微核細胞率,以千分率表示;每只小鼠觀察200個嗜多染紅細胞,同時計數(shù)正染紅細胞(NCE),計算PCE與NCE的比值,并進行統(tǒng)計學處理。

1.2.2.3 小鼠精子畸形試驗 取SPF級性成年雄性昆明小鼠25只,隨機平均分為5組,即受試物劑量低、中、高劑量組、陰性對照組和陽性對照組。按1.2.2.2給藥,連續(xù)經口灌胃受試物5 d。灌胃結束30 d后,脊椎脫臼處死小鼠,取兩側附睪放入盛有適量生理鹽水的小燒杯中,縱向剪開,靜止片刻后輕輕搖動,經四層擦鏡紙過濾,取濾液制片,干燥后經甲醇固定、伊紅染色(1 h)、蒸餾水沖洗、干燥后,鏡檢。每只小鼠計數(shù)1000個結構完整的精子,觀察精子形態(tài)和畸形類型,計算精子畸形率,并進行統(tǒng)計學分析。

1.2.3 90 d經口喂養(yǎng)試驗 選用SPF級Wistar斷乳大鼠80只(體重(70±10) g),雌雄各半,隨機平均分為4組,包括3個受試樣品的低、中、高劑量組和一個陰性對照組。按人體推薦量的100、200、300倍劑量,設低、中、高3個受試樣品組劑量分別為1.67、3.33和5.00 g/kg·bw。受試樣品摻入飼料中,并添加適量酪蛋白使各組飼料蛋白含量與常規(guī)飼料一致,各劑量組樣品摻入飼料的質量分數(shù)分別為2.08%、4.17%和6.25%。三個試樣品處理組大鼠分別喂養(yǎng)以上飼料,陰性對照組喂養(yǎng)常規(guī)飼料,所有大鼠單籠喂養(yǎng),自由飲食,連續(xù)90 d。每天記錄動物的一般臨床表現(xiàn)和行為表現(xiàn),以及中毒體征、程度、持續(xù)時間和死亡情況。每周記錄體重、飼料攝入量,計算食物利用率。試驗結束時,計算大鼠體重增長量、總攝食量和總食物利用率,并處死大鼠,留取部分血液用全自動血液分析儀進行血液學指標(血紅蛋白、紅細胞、白細胞、中性粒細胞、單核細胞和淋巴細胞)檢測,其余血液離心后,取血清用全自動生化分析儀進行生化學指標(谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶、尿素氮、肌酐、甘油三酯、膽固醇、血糖、血清白蛋白和總蛋白)測定。同時,對所有大鼠進行體檢,將重要器官和組織固定保存,將臟器(肝、脾、腎、胸腺、睪丸)稱重,計算相對重量(臟/體比值),并進行病理組織學檢查(肝、腎、脾、胃及十二指腸、胸腺、睪丸或卵巢)。

1.2.4 致畸試驗 將60只Wistar大鼠孕鼠隨機分為4組,即陰性對照組和低、中、高3個受試樣品組,每組15只。按1.2.3中所述制備飼料,3個受試物處理組孕鼠分別在受孕的第7～16 d喂養(yǎng)以上飼料,陰性對照組喂養(yǎng)常規(guī)飼料。孕鼠單籠喂養(yǎng),自由飲食,并分別于受孕的0、7、12、16、20 d稱量孕鼠體重,每天觀察并記錄動物的行為、表現(xiàn)、中毒和死亡現(xiàn)象。孕鼠于妊娠第20 d,經麻醉后解剖,迅速取出子宮并稱重,檢查并記錄活胎數(shù)、吸收胎數(shù)、早死胎數(shù)及晚死胎數(shù),以及胎鼠性別、體長、體重、尾長。

從每窩活胎鼠中取出一半胎鼠置于95%乙醇中固定3周后,取出胎仔,流水沖洗,放入20 g/L的KOH 溶液中至透明后取出,于茜素紅應用液中染色48 h,再依次放入透明液A(甘油∶氫氧化鉀∶蒸餾水=10∶1∶79)中2 d,透明液B(甘油∶蒸餾水=1∶1)中2 d,使軟組織基本褪色而骨骼染紅,于體視顯微鏡下先作整體觀察,然后依次檢查頭骨、脊柱骨、骨盆、四肢骨、腕骨、掌骨、趾骨、肋骨、胸骨等。將每窩的另一半活胎鼠置于Bouins液(2,4,6-三硝基酚∶40%甲醛∶冰乙酸=15∶4∶1)中固定兩周后,沿腹中線剪開腹腔、胸,依次檢查心臟、肺臟、橫膈膜、肝臟、胃、腸、腎臟、膀胱、輸尿管、子宮或睪丸等臟器的大小、位置及發(fā)育情況,并將腎臟切開,觀察有無腎盂擴大與積水,必要時還需對心臟內部結構進行檢查。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)分別進行One-way ANOVA分析及Dunnett檢驗,分析比較各組實驗數(shù)據(jù)及數(shù)據(jù)間的顯著性差異關系,檢驗水準α=0.05。

2 結果與分析

2.1 小鼠急性經口毒性試驗結果

急性經口毒性試驗是檢測實驗動物在一次或在24 h內多次經口給予受試樣品后,動物在短期內表現(xiàn)出的健康損害效應的實驗方法[7]。鑒于霍山石斛悠久的食用傳統(tǒng),本研究采用最大耐受量(MTD)方法進行試驗。結果表明,將霍山石斛莖樣品以15.0 g/kg·bw的劑量給小鼠灌胃,連續(xù)14 d后,雄性小鼠體重由初始的20.24 g增長至32.99 g,雌性小鼠體重由初始的19.40 g增長至28.44 g,兩種性別小鼠均未見死亡和明顯的中毒癥狀。肝臟、脾臟、腎臟、心臟、肺、胃、腸等主要器官均未見明顯異常改變。因此,霍山石斛莖對雌雄小鼠急性經口毒性試驗的最大耐受劑量(MTD)均大于15.0 g/kg·bw,相當于人體推薦劑量的900倍,根據(jù)急性毒性分級,屬于無毒級。

2.2 遺傳毒性試驗結果

2.2.1 Ames試驗 Ames試驗被廣泛用于受試樣品的致突變作用檢測[8-9]。結果(表1)表明,霍山石斛莖在加或不加S9時,各劑量組回變菌落數(shù)均未超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍,即致變比MR≤2,且無劑量-效應關系,根據(jù)GB15193.4-2014《食品安全國家標準細菌回復突變試驗》,判斷為致突變陰性,即霍山石斛莖對鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102菌株未呈現(xiàn)遺傳毒性。

表1 霍山石斛莖Ames試驗結果

2.2.2 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗 嗜多染紅細胞(Polychromatic erythrocyte,PCE)是細胞質內含有核糖體的未成熟紅細胞,Giemsa染色呈灰藍色。正染紅細胞(Normochromatic erythrocyte,NCE)為核糖體已消失的成熟紅細胞,Giemsa染色呈淡橘紅色[10-11]。PCE與NCE的比值(PCE/NCE)代表未成熟紅細胞與成熟紅細胞的比值,是評價細胞毒性的指標[12]。微核是染色體或染色單體的無著絲點斷片或因紡錘絲受損傷而丟失的整個染色體,通過測定骨髓PCE中含微核的細胞數(shù)量,計算微核率,并結合PCE與NCE比值可快速檢測外源誘變因素導致的染色體畸變[13-14]。

由表2可見,陰性對照組PCE微核率小于5‰,霍山石斛樣品各劑量組微核率與陰性對照組比較,無顯著性差異;環(huán)磷酰胺陽性組微核率大于30 ‰,與陰性對照組相比,有極顯著性差異(p<0.01),且霍山石斛樣品各劑量組PCE/NCE比值與陰性對照組相比無顯著差異?？梢?霍山石斛莖對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率及PCE與NCE比值均無影響。

表2 霍山石斛莖對小鼠骨髓微核率和PCE/NCE的影響Table 2 Effects of DHS on the frequency of micronucleus and PCE/NCE of

2.2.3 小鼠精子畸形試驗 生殖系統(tǒng)對于致突變物的敏感性高,所以常選用小鼠精子畸形試驗探討外源物質的生殖細胞毒性及對生殖細胞的致突變作用[15]。由表3可見,環(huán)磷酰胺陽性對照組小鼠精子畸形率明顯升高,與陰性對照組相比差異極顯著(p<0.01),而霍山石斛樣品各劑量組與陰性對照組相比,小鼠精子畸形率無顯著性差異,說明霍山石斛莖對小鼠精子畸形率無明顯影響。

表3 霍山石斛莖對小鼠精子畸形率的影響Table 3 Effects of DHS on abnormal rate in mouse

2.3 大鼠90 d喂養(yǎng)試驗結果

2.3.1 霍山石斛莖對大鼠體重和食物利用率的影響 在毒理學安全性評價中,動物體重和食物利用率是評價受試物是否導致動物某些指標異常及動物生長發(fā)育正常與否的重要指標。90 d喂養(yǎng)試驗過程中,各組動物生長發(fā)育、活動均正常,未見中毒和死亡現(xiàn)象;與陰性對照組相比,各劑量組動物每周體重、體重增加量、進食量和食物利用率均無統(tǒng)計學差異;90 d喂養(yǎng)結束時,與陰性對照組相比,各劑量組動物總體重增加量、總進食量和總食物利用率均無統(tǒng)計學差異(見表4),說明霍山石斛莖不會影響大鼠體重、進食量和食物利用率。

表4 喂養(yǎng)結束后大鼠總體重增加量及食物利用率Table 4 Total body weight gain and food utilization rates of rats after

2.3.2 霍山石斛莖對大鼠血液學指標的影響 紅細胞及血紅蛋白,白細胞數(shù)量及不同類型細胞所占比例是血液學的主要指標[16]。表5顯示,紅細胞及血紅蛋白在各試驗組中沒有差異,白細胞數(shù)量及不同類型細胞所占比例在不同試驗間也無統(tǒng)計學差異,說明霍山石斛莖對于大鼠血液學指標無不良影響。

表5 霍山石斛莖對對大鼠血液學指標的影響Table 5 Effect of DHS on hematological parameter of

2.3.3 霍山石斛莖對大鼠血液生化指標的影響 血糖(GLU)、尿素氮(BUN)、肌酐(GREA)、谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、甘油三酯(TG)和膽固醇(TC)是血液重要的生化指標[17-22]。由表6可知,霍山石斛莖高、中、低三個劑量組大鼠的血液生化指標與陰性對照組相比,無統(tǒng)計學差異,說明90 d喂養(yǎng)過程中霍山石斛莖并未影響大鼠的血液生化指標。

表6 霍山石斛莖對大鼠血液生化指標的影響Table 6 Effect of DHS on blood biochemical paremeters of

2.3.4 霍山石斛莖對大鼠病理學結果 臟器系數(shù)又稱臟/體比值,可反映在外界因素影響下臟器的水腫、增生、萎縮或充血等變化,是判斷外源物質作用靶器官的重要依據(jù)[23-24]。由表7可知,臟器的臟/體比值與陰性對照組相比無顯著性差異,表明霍山石斛莖對臟器無不良影響。組織病理學檢查發(fā)現(xiàn)，除高劑量組和對照組各有一只雄鼠肝細胞有輕度損傷外,其余動物肝臟、腎臟、脾臟、胃、十二指腸、胸腺、睪丸或卵巢組織未見有意義的病理學改變,說明霍山石斛莖(人工栽培)對受檢臟器無明顯損害。

表7 霍山石斛莖對大鼠臟體比的影響Table 7 Effect of DHS on the organ-to-body weight ratio of

2.4 致畸試驗

致畸試驗是利用大鼠孕期胚胎的器官發(fā)育與分化是否異常及異常程度來評價外源物質的致畸作用[25-26]。由表8顯示可知,不同劑量組與陰性對照組相比其體重均穩(wěn)定增加,至20 d各組體重增加無明顯差異。表9表明,與陰性對照組相比,各劑量組孕鼠卵巢重量、胎盤重量、子宮連胎重、平均黃體數(shù)、胚胎平均著床數(shù)、平均窩活胎均無顯著性差異。對活胎鼠的發(fā)育進行觀察和鏡檢發(fā)現(xiàn)(表10),與陰性對照組相比,各劑量組活胎鼠的性別比例、體重、身長和尾長均無顯著性差異;各劑量組胎鼠頭部、軀干、四肢外觀均未觀察到明顯畸形,胎鼠頭部器官(舌、腭、鼻、眼、腦),胸腔器官(肺臟、心臟、橫膈膜)及腹腔器官(肝、胃、腎、腸道、膀胱)均未發(fā)現(xiàn)異常;對照組和劑量組的枕骨、肋骨、椎骨、四肢骨均未見畸形,除陰性對照組和劑量組的個別動物胸骨骨化不全外,各組胎鼠的胸骨缺失率和畸形均無顯著性差異。以上試驗結果均說明，霍山石斛莖對于孕鼠及胎鼠發(fā)育及分化無不良影響,提示霍山石斛莖(人工栽培)對大鼠無致畸作用。

表8 霍山石斛莖對孕鼠體重的影響Table 8 Effect of DHS on the body weight of pregnant

表9 霍山石斛莖對孕鼠及胚胎發(fā)育的影響Table 9 Effect of DHS on the development of pregnant rat and

表10 霍山石斛莖對胎鼠的影響Table10 Effect of DHS on

3 結論

急性經口毒性試驗表明霍山石斛莖對于雌雄小鼠的最大耐受劑量(MTD)均大于15.0 g/kg·bw,屬于無毒級。Ames試驗判斷霍山石斛莖對鼠傷寒沙門氏菌四株試驗菌株均未呈現(xiàn)遺傳毒性,小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核試驗判斷霍山石斛莖對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率及嗜多染紅細胞與正染紅細胞(PCE/NCE)的比值均無影響,小鼠精子畸形試驗判斷霍山石斛莖各劑量組小鼠精子畸形率與陰性對照組相比無顯著性差異,表明霍山石斛莖無遺傳毒性。90 d喂養(yǎng)試驗發(fā)現(xiàn)，霍山石斛對大鼠的體重、進食量、食物利用率、臟器絕對重量、臟/體比值、血液學指標、血液生化指標、病理組織學檢查均無顯著性差異,表明霍山石斛莖不具有亞慢性毒性。與陰性對照組相比,霍山石斛莖各劑量組對大鼠孕鼠體重增長、胚胎早期發(fā)育及胎鼠的生長發(fā)育、胎鼠的骨骼、內臟和外觀發(fā)育均無明顯不良影響,表明霍山石斛莖對大鼠無致畸作用。綜上所述,霍山石斛莖在試驗劑量范圍內不具有毒性,食用安全。