蝦夷扇貝內(nèi)臟源金屬硫蛋白的提取工藝優(yōu)化

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(1.浙江省海洋水產(chǎn)研究所,浙江舟山 316021;2.浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室,浙江舟山 316021;3.浙江海洋大學(xué),浙江舟山 316021；4.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院,北京 100141)

金屬硫蛋白(metallothionein,MT)是一類廣泛存在于生物中的低分子質(zhì)量(6～7 kDa)、高金屬含量、無芳香族氨基酸、富含半胱氨酸(20%～30%)的功能獨特的金屬結(jié)合蛋白[1]。金屬硫蛋白中大量巰基賦予了其螯合重金屬離子功能,從而具備重金屬解毒作用[2],MT清除自由基的能力明顯強于超氧化物歧化酶和谷胱甘肽,還可調(diào)節(jié)生物體內(nèi)微量元素濃度,對細(xì)胞代謝的調(diào)節(jié),細(xì)胞分化和增殖的控制以及在參與紫外(UV)誘導(dǎo)反應(yīng)中都有重要作用,在食品、醫(yī)藥、保健、環(huán)境、化妝品、生物工程等領(lǐng)域中具有重要應(yīng)用價值[3-4]。較多文獻報道了從兔肝、真菌、細(xì)菌及海藻中提取金屬硫蛋白[5-7],貝類中的研究較少。目前只能購買到國內(nèi)市場上的兔肝源金屬硫蛋白,但其制備成本高,2018年市場價約為20萬元/克。蝦夷扇貝,濾食性雙殼貝類,是我國重要的養(yǎng)殖貝類之一。體內(nèi)尤其是內(nèi)臟團中易于富集重金屬[8]。工業(yè)中蝦夷扇貝的加工原材料多選用其閉殼肌,制成干制品或真空包裝食品,內(nèi)臟作為下腳料,利用率低。金屬硫蛋白主要富集在金屬元素含量豐富的肝臟、腎臟等內(nèi)臟器官中,因此蝦夷扇貝內(nèi)臟可以作為提取金屬硫蛋白的良好原材料,同時獲得其純品并研究應(yīng)用功能特性,推進金屬硫蛋白的廣泛使用意義重大。

本研究從蝦夷扇貝內(nèi)臟中提取金屬硫蛋白,采用單因素和響應(yīng)面法優(yōu)化其提取條件,并對得到的粗提物進一步研究,致力于得到一種高效快速的提取方法及低成本金屬硫蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蝦夷扇貝 購買自大連劉清水產(chǎn)品旗艦店;分子篩預(yù)裝柱(Enrich SEC 70)(BIO-RAD);三羥甲基氨基甲烷(Tris) 生物試劑,北京索萊寶科技有限公司;5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB) 色譜純,上海安譜實驗科技股份有限公司;MT-I對照品、MT-II對照品 大連聯(lián)合博泰生物技術(shù)有限公司;乙二胺四乙酸二鈉、鹽酸、檸檬酸、磷酸氫二鈉 均為優(yōu)級純,國藥集團。

T18勻漿機 ULTRA-TURRAX;JXN-30高速冷凍離心機 貝克曼庫爾特(Beckman Coulter Avanti);UV-3100BPC紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;微波消解儀 邁爾斯通(Milestone ETHOS A);7900電感耦合等離子體質(zhì)譜儀 安捷倫科技(中國)有限公司;全自動蛋白純化儀 美國伯樂(BIO-RAD)。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料處理方法 鮮活蝦夷扇貝用過濾海水(過0.22 μm除去雜質(zhì))沖洗后,去殼,取其內(nèi)臟團勻漿(轉(zhuǎn)速10000 r/min,每次3 min,重復(fù)三次),備用。

1.2.2 蝦夷扇貝內(nèi)臟中金屬元素含量測定 取勻漿組織適量,按照現(xiàn)行國標(biāo)方法[9],采用微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS),測定蝦夷扇貝中Zn、Pb、Cd、Cu、As幾種元素含量。

1.2.3 蝦夷扇貝內(nèi)臟中金屬硫蛋白提取 參閱相關(guān)文獻的提取方法并稍加修改[9-11]。取1.2.1中的勻漿組織適量,加入3倍體積(質(zhì)量/體積)Tris-HCl提取劑(提取劑需提前配制,放置4 ℃預(yù)冷),同時加入1%三(2-羧乙基)膦(Tris-2-carboxyethyl-fosphine,TCEP)作為還原劑,加入Tris-HCl提取溶液后4 ℃提取約15 h,然后10000 r/min離心20 min,收集上清液加熱至一定溫度,除掉熱不穩(wěn)定的大分子蛋白組分,冰水浴快速冷卻后4 ℃10000r/min離心20 min,收集上清液,加入3倍體積-20 ℃乙醇,4 ℃沉淀約15 h,最后4 ℃條件下將沉淀物分離,棄去上清液后加入10 mL Tris-HCl緩沖液,室溫下溶解3～4 h,溶液4 ℃再次10000 r/min離心20 min,收集上清液真空冷凍干燥后得到MT粗提物。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 Tris-HCl濃度對提取液中MT含量的影響 設(shè)定Tris-HCl的pH為8.0,加熱溫度為75 ℃,考察Tris-HCl濃度為0、0.01、0.02、0.03、0.04 mol/L時對提取液中MT含量的影響。

1.2.4.2 Tris-HCl pH對提取液中MT含量的影響 設(shè)定Tris-HCl的濃度為0.01 mol/L,加熱溫度為75 ℃,考察Tris-HCl提取劑pH為5、6、7、8、9時對提取液中MT含量的影響。

1.2.4.3 加熱溫度對提取液中MT含量的影響 設(shè)定Tris-HCl的濃度為0.01 mol/L,pH為8.0,考察加熱溫度為40、50、60、70、80 ℃時對提取液中MT含量的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面法優(yōu)化MT的提取工藝,選取Tris-HCl的濃度、Tris-HCl pH和加熱溫度為考察因素,利用Box-Behnken模塊設(shè)計三因素三水平試驗,對提取條件進行優(yōu)化,響應(yīng)面設(shè)計實驗因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計實驗因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface design

1.2.6 MT含量測定 選擇操作簡便,快速直觀的DTNB法測定樣品中MT含量。參閱文獻[12-14]中的方法并稍加改變。配制兔肝MT-I及MT-II混合對照品,濃度均為1 μg/μL。在試管中分別加入20、40、60、80、100、150 μL的MT標(biāo)準(zhǔn)溶液,加入10 μL 1.2 mol/L鹽酸溶液和200 μL 0.1 mol/L EDTA,置于暗處反應(yīng)10 min脫去金屬,之后加入5 mmol/L DTNB試劑混勻3 min,使MT與DTNB形成黃色絡(luò)合物,用0.01 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.25)稀釋至4 mL,在412 nm波長處測定顯色產(chǎn)物硫代硝基苯甲酸陰離子(TNBA)的量。樣品測定為加入1 mL樣品溶液,其他試劑同上。以兔肝MT-I及MT-II混合對照品濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程y=0.0172x-0.0061(R2=0.998),以此計算蝦夷扇貝內(nèi)臟源MT粗提物的濃度。

1.2.7 MT分離純化方法 選用親水性聚甲基丙烯酸酯填料的分子篩預(yù)裝柱(Enrich SEC 70),將兔肝-金屬硫蛋白對照品MT-I和MT-II用超純水溶解,配制成濃度為1 mg/mL,然后稀釋到0.25 mg/mL,7000 r/min 離心5 min,過0.22 μm濾膜,取1 mL樣品注入樣品環(huán)中,利用全自動蛋白純化儀進行分子篩柱層析。流動相0.01 mol/L的Tris-HCl(pH8.25),流速0.5 mL/min。同時監(jiān)測220、250、275 nm波長下流出液的信號值。流動相平衡2個柱體積后上樣,儀器連接自動收集器,每管收集3 mL。稱取適量蝦夷扇貝內(nèi)臟源MT粗提物復(fù)溶,7000 r/min離心5 min,過0.22 μm濾膜后上機,其他條件同上。以保留時間定性,峰面積占比計算純度。

淖爾水質(zhì)超標(biāo)物主要有pH值、全鹽量、氯化物和硬度，鹽分處于主導(dǎo)地位。根據(jù)農(nóng)田灌溉水質(zhì)要求和滴灌工程設(shè)計要求，降低鹽分和抗堵塞是淖爾水質(zhì)處理的關(guān)鍵?？紤]灌溉的低成本和實效性要求，水源處以分凌水或引黃灌溉水與淖爾蓄水量按一定比例混合稀釋，以降低淖爾鹽分含量。首部采用泵前低壓網(wǎng)式過濾器+疊片過濾器組合模式，田間采用抗堵型內(nèi)鑲貼片式灌水器可實現(xiàn)低成本高效過濾。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗樣品做3個平行,運用Excel 2010版對單因素試驗數(shù)據(jù)進行處理,運用Design Expert 8.0.1軟件對Box-Behnken實驗進行設(shè)計和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦夷扇貝內(nèi)臟中金屬元素含量測定

根據(jù)ICP-MS測定的上機濃度及稱樣質(zhì)量,計算出各金屬元素含量,具體數(shù)值見表2。由表2可知,在蝦夷扇貝內(nèi)臟中,Zn>Cd>Cu>As>Pb。這一結(jié)果與文獻報道結(jié)果一致[15-16]。Zn、Cu是生物體生長所需的微量元素,但含量過高也會對生物體產(chǎn)生危害。Cd不是蝦夷扇貝生長所需元素,但含量居第二高,說明蝦夷扇貝對Cd具有一定的富集作用。

表2 蝦夷扇貝內(nèi)臟中元素含量Table 2 The content of elements in Patinopecten yessoensis viscera

2.2 單因素試驗

2.2.1 提取劑濃度對MT含量的影響 Tris-HCl緩沖液性質(zhì)穩(wěn)定,與生理體液的相容性好,且其與鈣、鎂離子不會形成沉淀,而且相同pH、相同濃度的Tris-HCl緩沖液的離子強度比其他鹽類緩沖液的離子強度低,這對蛋白類測定尤為重要,因為高離子強度容易使某些蛋白質(zhì)降低活性甚至完全失去活性[17],所以選擇Tris-HCl作為提取劑。同時Tris-HCl緩沖液濃度與提取液中MT含量密切相關(guān)。由圖1可知,Tris-HCl濃度由0升至0.01 mol/L時,MT含量有增大的趨勢,但不明顯,Tris-HCl濃度由0.01升至0.03 mol/L時,MT含量緩慢下降,為更精確確定Tris-HCl濃度,響應(yīng)面優(yōu)化范圍設(shè)置為0.01～0.03 mol/L。

圖1 Tris-HCl濃度對MT含量影響Fig.1 The effect of concentration of extract on MT content

2.2.2 提取劑pH對MT含量的影響 Tris-HCl緩沖液pH受溫度影響大,一旦溫度改變,pH將發(fā)生變化,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)活性改變,所以提取過程中盡量保持同一溫度。同時考察pH對其含量的影響。由圖2可知,提取劑pH由5升至7時,MT含量逐漸增大,但pH在7～9時,MT含量變化不明顯。根據(jù)文獻報道,水生生物金屬硫蛋白的等電點在3.5～6.0之間[11],為防止提取時金屬硫蛋白產(chǎn)生沉淀,Tris-HCl溶液的pH比等電點高一個單位左右,進一步參照相關(guān)文獻[7],MT提取劑多為堿性,為進一步精確確定pH范圍,綜合以上因素將響應(yīng)面優(yōu)化范圍設(shè)置為7.40～9.10。

圖2 Tris-HCl pH對MT含量影響Fig.2 The effect of pH on the content of MT

2.2.3 加熱溫度對MT含量的影響 MT本身具有一定的耐熱性,可利用這一特性除去多數(shù)熱不穩(wěn)定蛋白質(zhì),進一步提高MT含量。由圖3可知,隨著溫度升高,MT含量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢,加熱溫度在60 ℃時MT含量最高。結(jié)合單因素結(jié)果及考慮MT的熱穩(wěn)定性,同時為除去一些不耐熱的雜蛋白,因此,響應(yīng)面實驗優(yōu)化范圍設(shè)置為60～80 ℃。

圖3 加熱溫度對MT含量的影響Fig.3 The effect of heating temperature on the content of MT

2.4 響應(yīng)面試驗

2.4.1 響應(yīng)面模型與分析 根據(jù)單因素實驗結(jié)果設(shè)計響應(yīng)面試驗因素水平,響應(yīng)面實驗設(shè)計方案及結(jié)果如表3。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Response surface design and results

表4 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of the regression model

由方差分析可知,該模型的F=9.03,p=0.0042<0.01,表明實驗采用的二次模型是極顯著的[18],在統(tǒng)計學(xué)上是有意義的。模型的失擬項的F=4.64,p=0.0860>0.05,不顯著,說明該模型具有很好的擬合度。因素A Tris-HCl緩沖液濃度的p=0.0008<0.01,說明提取劑濃度對提取液中MT含量的影響是極顯著的(p<0.01),對于A2、B2其p值均小于0.01,說明C2的p值小于0.05,說明C2對提取液中MT含量的影響是顯著的(p<0.05),而B、C一次項及3個因素的二次交互項的影響均不顯著(p>0.05),結(jié)合F值可知,A、B及C三因素對MT含量的影響依次為:A(提取劑濃度)>C(加熱溫度)>B(提取劑pH)。

2.4.2 響應(yīng)面優(yōu)化 響應(yīng)面是各因素對響應(yīng)值影響結(jié)果構(gòu)成的三維空間曲面圖,可直接反映各因素與響應(yīng)值的交互作用。曲面越陡峭,對響應(yīng)值的影響越大,而等高線形狀可反映因素交互作用的顯著程度[19-20]。響應(yīng)曲面及等高線圖如圖4所示。從圖4可以看出響應(yīng)面都為開口向下的凸形曲面,說明實驗存在提取液中MT含量的最大值。由圖4b等高線圖可知,A和B兩因素的等高線成橢圓形,沿A軸提取劑濃度的等高線較為密集,B軸提取劑pH的等高線較為稀疏,說明提取劑濃度對MT含量的影響比提取劑pH的影響大,3D曲面圖也可看出提取劑濃度的影響大于提取劑pH;圖4d中,B與C的等高線成圓形,說明B、C兩因素交互作用對MT含量的影響不顯著;由圖4f等高線圖可知,A和C兩因素的等高線成橢圓形,沿A軸提取劑濃度的等高線較為密集,沿C軸加熱溫度的等高線較為稀疏,說明提取劑濃度對MT含量的影響比加熱溫度的影響大,由3D圖可知提取劑濃度對MT含量的影響要高于加熱溫度。因此,結(jié)合等高線、3D圖及F值可知,三因素對MT含量的影響依次為:提取劑濃度>加熱溫度>提取劑pH。提取劑濃度與提取劑pH的響應(yīng)面圖和提取劑濃度和加熱溫度的響應(yīng)面圖都比較陡峭,說明它們的交互作用比較明顯,這與表4的回歸分析結(jié)果一致。

圖4 各因素交互作用對MT含量影響3D圖及等高線圖Fig.4 Response surface showing the effect of different factors on the total MT and contour

2.4.3 最優(yōu)條件的優(yōu)化與驗證 根據(jù)Design-expert 8.0.1軟件處理實驗數(shù)據(jù)所得結(jié)果,蝦夷扇貝內(nèi)臟中金屬硫蛋白的最佳提取條件為,Tris-HCl提取劑濃度為0.01 mol/L,提取劑pH為8.23,加熱溫度為69.79 ℃,在此條件下,最佳響應(yīng)結(jié)果為0.127 mg/g。實際實驗選擇為Tris-HCl提取劑濃度為0.01 mol/L,提取劑pH為8.23,加熱溫度為70 ℃,實際測得的MT含量為0.115 mg/g。因此響應(yīng)面法得到的預(yù)期優(yōu)化條件不僅準(zhǔn)確可靠,而且具有實際價值。

2.5 MT分離純化

將兔肝-金屬硫蛋白混合對照品和蝦夷扇貝內(nèi)臟源粗提物經(jīng)分子篩柱層析后,同時監(jiān)測3個波長下流出液的信號值,MT-I和MT-II混合對照品流出液及蝦夷扇貝內(nèi)臟源粗提物均在λ=220 nm時響應(yīng)值最大。對照品譜圖如圖5,按保留時間先后順序分別命名為MF1、MF2,蝦夷扇貝內(nèi)臟源粗提物譜圖如圖6所示,按保留時間先后順序分別命名為Py1、Py2。由圖5、圖6可知,蝦夷扇貝內(nèi)臟源粗提物中組分的保留時間與兔肝-金屬硫蛋白混合對照品的保留時間接近,且都在λ=220 nm響應(yīng)值最高,據(jù)此可推測粗提液中組分即為蝦夷扇貝內(nèi)臟源金屬硫蛋白2種異構(gòu)體的混合物。MT與金屬結(jié)合而產(chǎn)生的特征吸收峰為:Zn-MT 220 nm,Cd-MT 250 nm,Cu-MT 275 nm,據(jù)吸收峰對MT進行分離鑒定[21-22]。而結(jié)合ICP-MS多元素測定結(jié)果,原材料中Zn含量明顯高于Cd、Cu的含量,兔肝源對照品結(jié)合的也是Zn,綜合以上因素可以推測提取到的MT類型為Zn-MT。由于MT-I和MT-II對照品分子量接近,所以在分子篩柱層析中較難分開。同理推測樣品中為金屬硫蛋白的2種異構(gòu)體。對圖譜中各個峰積分后,按峰面積占比算得蝦夷扇貝內(nèi)臟源粗提液中金屬硫蛋白的純度平均為81%。

圖5 兔肝金屬硫蛋白混合對照品圖譜Fig.5 Chromatogram of 2 kinds of MTs in standard solution

圖6 樣品圖譜Fig.6 Chromatogram of sample

3 討論與結(jié)論

通過單因素及響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件,獲得了各因素的最佳值:Tris-HCl提取劑濃度為0.01 mol/L,提取劑pH為8.23,加熱溫度為70 ℃。在此條件下,實際實驗結(jié)果為0.115 mg/g,與模型預(yù)測的理論值基本相符。因此,本研究得到了從蝦夷扇貝內(nèi)臟中提取金屬硫蛋白的有效方法。一步純化后,獲得2種異構(gòu)體的金屬硫蛋白混合物,其純度約為81%。

目前關(guān)于金屬硫蛋白的研究已有多篇報道。Rubens T H等[23]經(jīng)過一步親和色譜柱層析技術(shù)從亞馬遜大蓋巨脂魚和釀酒酵母中獲得了純度較高的金屬硫蛋白。Sandra S R等[24]通過HPLC-ICP-OES將貽貝中類金屬硫蛋白分離開,色譜柱類型為陰離子交換,流動相選用75 mmol/L Tris-HCl(pH7.4),流速0.8 mL/min。兩種類金屬硫蛋白在10 min內(nèi)可分離開。Carolina L T-D等[14]從羅非魚的膽汁和肝臟中提取到了MT,采用響應(yīng)面法優(yōu)化了加熱溫度、2次離心時間及在提取劑中加入不同的還原劑等因素對MT得率的影響,采用分光光度法測定MT濃度,SDS-PAGE測定相對分子質(zhì)量。上述研究成果均獲得了純度較高的金屬硫蛋白,本文研究結(jié)果與上述研究結(jié)果類似,獲得了2種類型MT的混合物。后續(xù)還需進一步將2種類型MT分離,獲得純品后還需進行結(jié)構(gòu)鑒定。雖然關(guān)于金屬硫蛋白的研究成果已較多,但關(guān)于其結(jié)構(gòu)鑒定方法卻鮮有報道。只有掌握蛋白結(jié)構(gòu)才能全面了解其性質(zhì),從而為其充分廣泛的應(yīng)用提供全面的理論知識。所以,對金屬硫蛋白結(jié)構(gòu)的鑒定意義重大,今后也將在此領(lǐng)域進行深入研究。