嗜酸乳桿菌KLDS1.0901表層蛋白對菌株黏附特性的影響

,,,,

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué),乳品科學(xué)教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030)

乳酸菌的表層蛋白(Surface layer protein,S-layer protein/SLP),又稱S-層蛋白,指通過非共價作用,連接于多數(shù)細菌和古生菌的細胞壁和細胞膜最外層的蛋白結(jié)構(gòu)[1-2]。乳桿菌的表層蛋白在已知的表層蛋白中是最小的一類,相對分子質(zhì)量處于25～71 kDa之間,占細胞蛋白總量的 10%～15%,等電點普遍呈弱堿性[3]。但并非所有乳桿菌都具有表層蛋白結(jié)構(gòu),已知攜帶表層蛋白的乳桿菌有L.acidophilus、L.helveticus、L.brevis、L.crispatus、L.kefir、L.buchneri、L.parakefir、L.gasseri等。目前,對L.acidophilus的表層蛋白研究最廣泛且較深入。

關(guān)于SLP結(jié)合到細胞外基質(zhì)(ECM)蛋白并黏附到腸上皮細胞的直接實驗證據(jù)己在L.acidophilusNCFM的SlpA蛋白[4-5]、L.capillarisJCM5810的CbsA蛋白[6]、L.crispatusZJ001中的SlpB蛋白[7]和L.brevisATCC8187的SlpA[8]蛋白中證實。但是對于SLP具體哪一段氨基酸序列會參與ECM組分的黏附,有研究表明L.crispatusJCM5810 CbsA蛋白N端位置31-274處的氨基酸殘基是與雞結(jié)腸膠原蛋白結(jié)合所必需的結(jié)構(gòu)域[9]。L.brevisATCC 8287的S-層蛋白SlpA介導(dǎo)了菌體細胞與人結(jié)腸癌上皮細胞系和纖連蛋白的結(jié)合,并且SlpA N末端的81個氨基酸就足以與上皮細胞結(jié)合[10]。

表層蛋白對酸菌發(fā)揮益生功能也有著卓著的貢獻。SLP除了作為黏附因子介導(dǎo)乳桿菌黏附定殖于腸道上細胞或ECM蛋白,以延長其在腸道中發(fā)揮益生作用的時間和保護菌體之外。還有助于乳桿菌抑制病原菌對腸道組織的感染,減少致病菌對腸道的細胞傷害,以及調(diào)節(jié)免疫的功能[5]。L.acidophilusATCC 4356 的SLP可以結(jié)合特異性抗原DC-SIGN,調(diào)節(jié)免疫反應(yīng),抑制胡寧病毒引起的細胞損傷[11]。

分離自新疆發(fā)酵酸馬奶的L.acidophilusKLDS1.0901具有良好的耐酸、耐堿鹽特性,能抑制致病菌的生長,改善腹瀉[12]。本實驗從體外探究了L.acidophilusKLDS1.0901的菌體濃度、生長階段以及其表面的表層蛋白對其黏附Caco-2細胞的影響,并通過體內(nèi)試驗進行驗證。通過5 mol/L LiCl處理提取菌體表面的相關(guān)蛋白,采用透射電鏡和SDS-PAGE進行分析鑒定。初步探討KLDS1.0901的黏附機制,分析其表層蛋白的特性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜酸乳桿菌KLDS1.0901 分離自中國新疆地區(qū)發(fā)酵酸馬奶,保藏于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點實驗室;人體結(jié)腸腺癌細胞系Caco-2細胞株 中國科學(xué)院上海細胞庫;MRS培養(yǎng)基 采用參考文獻[9]的方法制備;高糖DMEM培養(yǎng)基 美國HyClone;青霉素-鏈霉素雙抗、0.25%胰蛋白酶-EDTA、牛血清蛋白 美國Gibco公司;MULTICELL胎牛血清 UK;cFDA-SE 碧云天;BALB/c小鼠 6～8周齡,許可證號SCXK(黑)2013-001,黑龍江品臣科技有限公司。

ZHWY-100B型臺式振蕩器 上海智誠分析儀器制造有限公司;DB-3B型電子天平 沈陽龍騰電子有限公司;HVE-50型高壓滅菌鍋 日本HIRAYAMA公司;GL-21M型高速冷凍離心機 上海市離心機械研究所有限公司;DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;Heal Force型細胞培養(yǎng)箱 力康醫(yī)療生物科技控股有限公司;DMLB型光學(xué)顯微鏡 德國徠卡顯微鏡與系統(tǒng)公司;H-7650透射電子顯微鏡 日本日立公司;SectrumLab54型紫外分光光度計 上海棱光技術(shù)有限公司;Aira II流式細胞儀 美國BD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 嗜酸乳桿菌的培養(yǎng) 供試菌株嗜酸乳桿菌KLDS1.0901在試驗前需進行復(fù)蘇與純化,經(jīng)MRS液體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng),連續(xù)傳代3次以恢復(fù)菌種活力,后用無菌PBS緩沖液(pH7.2)洗滌菌體,并用PBS調(diào)整到所需濃度。

1.2.2 Caco-2細胞的培養(yǎng) 從液氮罐中取出Caco-2細胞,將凍存管迅速置于37 ℃水浴中復(fù)蘇細胞,4 ℃ 1000 r/min離心5 min,收集細胞后,加入4 mL雙抗高糖DMEM培養(yǎng)基(10%的熱滅活胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素),置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng),每隔1～2 d更換培養(yǎng)液;待細胞生長狀況良好時(70%～80%融合),進行傳代。用于黏附測定的Caco-2細胞,單層細胞培養(yǎng)于24孔板中,接種量為105CFU/mL,單層細胞培養(yǎng)10 d左右時,達到極化狀態(tài)后,即可用于黏附試驗,在進行黏附試驗前24 h 需更換不含雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基。

1.2.3 菌液濃度對黏附作用的影響 參照陳臣等[13]的方法并略做改動。將培養(yǎng)好的極化細胞接種在24孔板中,待其在孔板底部形成單細胞層后,用無菌的PBS溶液洗滌2次,再將500 μL不同濃度(107、108、109、1010CFU/mL)的嗜酸乳桿菌懸液加入到孔板中,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后,用PBS溶液洗滌24孔板中每孔的單層細胞層3次以上,以洗脫沒有黏附的細菌和代謝分泌物。然后向每個孔中加入250 μL 0.25%胰蛋白酶-EDTA孵育10 min;再加入250 μL血清終止消化;收集每個孔內(nèi)溶液,并分別進行10倍梯度稀釋,采用平板菌落計數(shù)法檢測培養(yǎng)后菌株的活菌數(shù)(V1)。V0為加入到24孔板中總的活菌數(shù)。黏附率(%)計算如下:

黏附率(%)=(V1/V0)×100

1.2.4 生長階段對黏附作用的影響 選擇對數(shù)初期、對數(shù)生長中期、對數(shù)末期、穩(wěn)定末期的KLDS1.0901的菌體進行黏附實驗。采用比濁法測定KLDS1.0901的生長曲線[12]。取4、8、12、16、20 h時期的菌體,并調(diào)整其濃度為108CFU/mL。取不同生長時期的菌懸液500 μL,加入到鋪滿單細胞層的24孔板中,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。黏附率的計算方法同1.2.3。

1.2.5 嗜酸乳桿菌的表層蛋白對黏附作用的影響

1.2.5.1 嗜酸乳桿菌的熒光標記 用二甲基亞砜(DMSO)溶液配制成1 mmol/L cFDA-SE儲備液,進行熒光標記[3]。具體配制方法:稱取5.0 mg cFDA-SE溶解于8.969 mL DMSO溶劑中。再過濾膜(0.22 μm)除菌,最后儲存在-20 ℃中備用。將菌體重新懸于PBS溶液中,配制活性嗜酸乳桿菌溶液(108CFU/mL)、去除表層蛋白的嗜酸乳桿菌溶液(108CFU/mL)、熱致死嗜酸乳桿菌溶液(108CFU/mL)。熱致死嗜酸乳桿菌由活性菌體在70 ℃水浴鍋中加熱30 min制得。再分別向制備的乳桿菌懸液中加入cFDA-SE儲備液,至最終濃度為20 μmol/L,37 ℃避光靜置15 min,4 ℃ 8000 r/min離心10 min,再用PBS(pH7.2)洗滌三次,除去多余的熒光染料。再分別重懸于無菌PBS溶液中。用流式細胞儀檢測分析cFDA-SE標記情況(激發(fā)波長為488 nm)。

1.2.5.2 除去嗜酸乳桿菌的表層蛋白 先在24孔細胞培養(yǎng)板中準備好分化的單細胞層,用無菌PBS溶液洗滌兩次。再分別向每孔中加入500 μL去除表層蛋白的嗜酸乳桿菌[11]并進行熒光標記。加入相同體積濃度的未除去表層蛋白的嗜酸乳桿菌作為對照,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。將不經(jīng)任何處理的嗜酸乳桿菌的黏附率的平均值定義為100%,將處理組與未處理組相比得到其相對黏附率。

1.2.5.3 去除表層蛋白的嗜酸乳桿菌與表層蛋白的可逆性結(jié)合 表層蛋白與細菌表面的基團通過非共價鍵連接,不具特異性,故表層蛋白可以與表層蛋白去除的嗜酸乳桿菌可逆性結(jié)合[3]。因此,將氯化鋰處理過的嗜酸乳桿菌(去除表層蛋白)重懸于對應(yīng)的表層蛋白溶液中,4 ℃共孵育12 h后,4000 r/min離心5 min,收集菌體,熒光標記后進行黏附實驗。

1.2.5.4 表層蛋白對乳桿菌黏附抑制實驗 用表層蛋白粗品(提取方法見1.2.7.2)配制0、50、100、150、200 μg/mL溶液先與單細胞層孵育1 h后,用無菌PBS溶液(pH7.2)洗滌3次,再向每孔中加入500 μL熒光標記的KLDS1.0901溶液(108CFU/mL),在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。計算相對黏附率方法同1.2.5.2。

1.2.6 體內(nèi)黏附試驗 購買6～8周齡的BALB/c小鼠48只,按平均質(zhì)量無顯著差異隨機分成4組,每組12只。分組情況如表1。除對照組外各組小鼠均灌胃200 μL cFDA-SE標記的菌懸液一次(見表1)。灌胃后的所有小鼠均提供充足的普通飼料和飲水。分別在灌胃后的第1、2、4、7 d定時間點脫頸處死小鼠,并在無菌環(huán)境下取小鼠的橫結(jié)腸、回腸、空腸、十二指腸各2 cm,并小心剪開腸壁,小心清理掉腸壁內(nèi)容物,用載玻片輕輕刮下腸黏膜,并用1 mL無菌PBS溶液反復(fù)沖洗腸道內(nèi)壁,再用0.75%的甲醛固定,避光儲存,于488 nm的激發(fā)光波長下進行流式細胞儀檢測。分析腸道不同位置黏附的cFDA-SE標記的乳桿菌情況。不同腸道嗜酸乳桿菌黏附量計算公式如下:

表1 小鼠分組情況Table 1 Grouping of mice

黏附量(CFU/cm)=乳桿菌總數(shù)/2

1.2.7 KLDS1.0901表層蛋白的分離與鑒定

1.2.7.1 透射電子顯微鏡分析KLDS1.0901表面結(jié)構(gòu) 4 ℃ 8000 r/min離心10 min收集過夜培養(yǎng)的菌體,無菌PBS(pH7.2)洗滌2次。將菌體重懸于5 mL PBS溶液中,作為對照組。處理組將菌體懸浮于5 mL 5 mol/L LiCl溶液中。兩組置于37 ℃ 200 r/min搖床孵育30 min。采用Gerbino等[14]的方法。4 ℃ 8000 r/min離心10 min收集菌體,將其懸于2%戊二醛溶液中,固定2 h。固定后的菌體用PBS(pH7.2)洗滌3次,用1%磷戊酸染色1 h,再經(jīng)乙醇梯度脫水。最后用透射電子顯微鏡觀察并拍攝照片。

將粗提液先過0.22 μm的無菌親水性微孔濾膜,再將濾液裝入透析袋中,透析袋放于裝去離子水的水槽中,在4 ℃條件下透析,期間6 h更換一次透析液。用10 g/mL的AgNO3檢測透析液,直到?jīng)]有白色沉淀析出。將透析得到的懸濁液4 ℃ 10000 r/min離心10 min,收集沉淀,將沉淀先在-20 ℃預(yù)凍2 h,再-50 ℃冷凍干燥12 h。得到的表層蛋白粗品,保藏于-20 ℃冰箱中,備用。

1.2.7.3 表層蛋白的含量及相對分子質(zhì)量的測定 表層蛋白含量的測定:采用考馬斯亮藍G250法測定粗提物中表層蛋白的含量[16]。牛血清蛋白標準曲線的制作參照劉延琳等[17]的方法。

SDS-PAGE:采用12%分離膠、5%濃縮膠的SDS-PAGE連續(xù)電泳鑒定表層蛋白并測定其相對分子質(zhì)量。將表層蛋白粗提物溶解在1% SDS溶液中,在2×樣品處理緩沖液中加入表層蛋白樣品液,沸水浴5 min,上樣量為10 μL。電泳電壓:分離膠120 V,濃縮膠80 V。并用考馬斯亮藍對凝膠進行染色,乙酸脫色到出現(xiàn)清晰的蛋白質(zhì)條帶。拍照并計算蛋白質(zhì)樣品中表層蛋白的相對分子質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果均以平均數(shù)±標準差來表示,采用Origin 8.0對實驗數(shù)據(jù)進行做圖及擬合處理。運用SPSS 20.0軟件,進行獨立樣本T檢驗和單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜酸乳桿菌的濃度對黏附性的影響

如圖1,不同菌液濃度顯著影響對KLDS1.0901黏附能力(p<0.05)。菌體濃度低于108CFU/mL時,隨著加入菌體濃度的升高,單細胞層黏附率也在增加,但菌體濃度達到108CFU/mL時,KLDS1.0901黏附率趨于穩(wěn)定,表明黏附基本上達到飽和。所以動物實驗選擇濃度為108CFU/mL的KLDS1.0901進行灌胃。

圖1 KLDS1.0901濃度對黏附Caco-2細胞能力的影響Fig.1 The effect of KLDS1.0901 concentration on the adhesion ability to Caco-2 cells

2.2 乳桿菌的生長階段對黏附性的影響

根據(jù)KLDS1.0901的生長曲線圖(圖2),分別選擇對數(shù)初期(4 h)、對數(shù)生長中期(8、12 h)、對數(shù)末期(16 h)、穩(wěn)定末期(20 h)的KLDS1.0901的菌體進行黏附實驗,結(jié)果如圖3所示。KLDS1.0901在對數(shù)生長末期(16 h)的黏附率最高。且當培養(yǎng)時間小于16 h時,黏附的細菌數(shù)隨著菌齡的增加而顯著增加(p<0.05),穩(wěn)定末期黏附率趨于下降,但無明顯差異。表明對數(shù)末期或穩(wěn)定初期的KLDS1.0901黏附能力最好。

圖2 KLDS1.0901的生長曲線Fig.2 The growth curve for KLDS1.0901

圖3 KLDS1.0901生長階段對黏附Caco-2能力的影響Fig.3 The effects of KLDS1.0901 growth stages on the adhesion ability to Caco-2

2.3 表層蛋白對KLDS1.0901黏附性的影響

2.3.1 乳桿菌的熒光標記結(jié)果 如圖4所示,cFDA-SE熒光染料標記對菌體的標記率均達到99%以上,可用于后續(xù)實驗。

圖4 cFDA-SE標記熒光染料標記乳桿菌的效果Fig.4 Effect of cFDA-SE fluorescent dye labeling lactobacillus 注:A:未標記的KLDS1.0901;B:標記的KLDS1.0901;C:標記的去除SLP的KLDS1.0901;D:標記的熱致死KLDS1.0901。

2.3.2 處理方式對黏附性的影響 表面蛋白具有可逆地與細胞壁再次結(jié)合的能力[18]。由表2可知,與未處理的KLDS1.0901對Caco-2細胞的相對黏附率相比,經(jīng)過5 mol/L LiCl去除表層蛋白KLDS1.0901的黏附率下降顯著(p<0.05),是未處理乳桿菌黏附率的60%。而菌體去除表面蛋白后再與表面蛋白孵育12 h后進行黏附實驗,其黏附率相對于去除表層蛋白菌體增加了10%。部分表層蛋白可能可逆地與細胞壁進行了再次結(jié)合。可見,表層蛋白對嗜酸乳桿菌KLDS1.0901的黏附特性影響較大。

表2 處理方式對KLDS1.0901黏附能力的影響Table 2 Effects of treatment methods on adhesion ability of KLDS1.0901

2.3.3 表層蛋白對KLDS1.0901黏附性驗證 圖5可知,隨著加入表層蛋白濃度的增加,嗜酸乳桿菌的相對黏附率也隨之降低,說明表層蛋白抑制了乳桿菌與細胞的黏附?？赡苡捎诒韺拥鞍紫日紦?jù)細胞上的黏附位點,從而降低了乳桿菌的黏附性。

圖5 表層蛋白對KLDS1.0901的黏附能力抑制實驗Fig.5 The inhibition of KLDS1.0901 SLP to the adhesion ability

2.4 體內(nèi)黏附能力評價

為進一步驗證表層蛋白對嗜乳桿菌KLDS1.0901體內(nèi)黏附性的影響,用cFDA-SE標記處理方式不同的乳桿菌給小鼠灌胃,分別在灌胃后的第1、2、4、7 d用流式細胞儀檢測標記的乳桿菌在小鼠腸道中的黏附分布情況,結(jié)果如圖6所示。未處理的KLDS1.0901、去除SLP的KLDS1.0901和熱致死KLDS1.0901在腸道的不同部位黏附率不同,但未處理的菌體黏附率后期較高。在十二指腸中,去除SLP的KLDS1.0901在第1 d的黏附數(shù)量多于未處理及熱致死的KLDS1.0901,但是在第2 d顯著下降(p<0.05),無黏附能力;而未處理的KLDS1.0901在第2 d黏附數(shù)量最高,并在第2、4和7 d顯著高于去除SLP和熱致死的KLDS1.0901?？漳c中,隨著時間的增加,去除SLP的乳桿菌黏附于小腸數(shù)量顯著減少(p<0.05)。末端回腸和結(jié)腸是未處理KLDS1.0901黏附定植的主要部位。第7 d,未處理KLDS1.0901在回腸和結(jié)腸的黏附量都比較高,而且呈增長趨勢?；啬c中未處理KLDS1.0901的黏附數(shù)量一直明顯高于去除SLP和熱致死組;在結(jié)腸中,未處理KLDS1.0901的黏附數(shù)量隨著時間的延長一直在增加,且顯著高于去除SLP組(p<0.05),而去除SLP組和熱致死組的黏附量在第2 d后不斷減少。綜上所述,KLDS1.0901的表層蛋白顯著影響著其黏附特性,這與體外試驗結(jié)果基本一致。

圖6 KLDS1.0901表層蛋白對其黏附小鼠腸道能力的影響Fig.6 Effect of KLDS1.0901 surface layer protein on its intestinal adhesion to mice

2.5 KLDS1.0901表層蛋白的鑒定

2.5.1 KLDS1.0901表層結(jié)構(gòu)的顯微觀察 如圖7所示,在透射電鏡下,可以看到未處理的KLDS1.0901細胞壁外圍包裹著表層結(jié)構(gòu),但經(jīng)LiCl處理后,表層結(jié)構(gòu)即消失。這與孟君[18]觀察到的乳桿菌表層蛋白結(jié)構(gòu)類似。

圖7 透射電鏡觀察嗜酸乳桿菌的表層結(jié)構(gòu)(20000×)Fig.7 Observation of the cell surface structures by transmission electron microscopy(20000×)注:A:未處理的KLDS1.0901;B:除去SLP的KLDS1.0901。

2.5.2 表層蛋白的含量及相對分子質(zhì)量 如圖8,牛血清蛋白的線性關(guān)系較好。當表層蛋白粗品濃度為300 μg/mL 時,其在A595處吸光值為0.4±0.05,粗品中表層蛋白含量約為15.6%。

圖8 牛血清蛋白標準曲線Fig.8 The standard curve bovine serum albumin

如圖9所示,兩個不同濃度的粗品蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析后,均出現(xiàn)了一條較寬且清晰的電泳條帶,說明KLDS1.0901主要含一種表層蛋白,且分子量大約在43 kDa。這與已報道的L.acidophilusATCC 4356表層蛋白相對分子質(zhì)量(43.6 kDa)相接近[19]。

圖9 嗜酸乳桿菌KLDS1.0901表層蛋白粗提物圖譜Fig.9 SDS-PAGE of SLP extractions from L. acidophilus KLDS1.0901注:1,2:0.8 mg/mL的表層蛋白粗提物;3,4:0.5 mg/mL的表層蛋白粗提物。

3 結(jié)論與討論

本試驗通過體內(nèi)和體外證明了嗜酸乳桿菌KLDS1.0901表層蛋白能顯著影響其黏附特性,并且活性嗜酸乳桿菌KLDS1.0901能較好的黏附于小鼠腸道。KLDS1.0901含有豐富的表層蛋白,含量約為15.6%,相對分子量為43 kDa左右。所以KLDS1.0901具有益生菌的潛力。

乳桿菌可通過抑制病原體的侵襲,改善腸道上皮屏障功能,調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)等來發(fā)揮有益作用。而乳桿菌在胃腸道中的黏附和定植是其在人體內(nèi)表現(xiàn)益生功效的先決條件[20]。乳桿菌濃度、生長狀態(tài)和表層蛋白均顯著影響菌體黏附量。謝瓊[21]發(fā)現(xiàn),植物乳桿菌ZDY2013對Caco-2細胞的黏附存在著濃度依賴性關(guān)系,在實驗濃度范圍內(nèi),該菌的黏附數(shù)量隨著菌懸液濃度的增加顯著提高。而本試驗中,當KLDS1.0901的濃度增大,黏附Caco-2細胞的數(shù)量也隨之增加,但當菌體濃度在108CFU/mL以上時,其黏附性沒有顯著差異,說明細胞表面黏附素受體被占用完。乳桿菌在不同生長階段的細胞活性,形態(tài)大小、代謝產(chǎn)物、表面生長速率存在差異。Savage[22]研究了22株乳桿菌生長階段與黏附的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)大部分乳桿菌在穩(wěn)定期的黏附能力要好于指數(shù)期。這與本實驗結(jié)果相似。本實驗表明,對數(shù)生長末期的嗜酸乳桿菌KLDS1.0901的黏附性最大,這可能是因為其在對數(shù)生長末期,細胞形態(tài)趨于完整,且表達較高的黏附素。

乳酸菌的黏附分為非特異性黏附和特異性黏附[23-24]。非特異性黏附是借趨化作用使細菌和易感宿主細胞表面接近及定位,繼之細菌粘附素與易感宿主細胞表面處于靜電荷及疏水性結(jié)合;第二步是特異性的,即在第一步的基礎(chǔ)上,黏附素進一步與相應(yīng)的特異性受體結(jié)合。通過本實驗結(jié)果表明,KLDS1.0901表面的表層蛋白能夠特異性與Caco-2細胞表面的受體特異性結(jié)合,而具體與那種受體物質(zhì)作用還需要進一步深入探究。目前有關(guān)乳酸菌黏附素受體的研究很少。早前Mukai[25]對羅伊氏乳桿菌(L.reuteri)的研究表明,其能特異性地與腸上皮細胞外側(cè)的糖脂和硫苷脂結(jié)合,這兩種成分可能是黏附素受體。本實驗進一步從體內(nèi)實驗驗證了表層蛋白確實能影響KLDS1.0901在小鼠腸道內(nèi)的黏附定殖情況。

經(jīng)過熒光標記的活性KLDS1.0901能較好地黏附于小鼠腸道,在腸道各部位的黏附量存在差異。第1 d主要黏附于十二指腸和空腸,隨著時間的推移,KLDS1.0901趨向于黏附結(jié)腸。而去除表層蛋白和熱致死的KLDS1.0901雖然在第1 d能大量黏附于十二指腸,但是只能短暫停留于腸道各部位,隨著時間推移,這兩組在腸道各部位的黏附量顯著減少。

本研究通過透射電鏡觀察KLDS1.0901的表層結(jié)構(gòu)、和用SDS-PAGE分析表層蛋白粗品,對嗜酸乳桿菌表面的表層蛋白進行了初步鑒定,但具體的功能與結(jié)構(gòu)需進一步分析。而嗜酸乳桿菌的表層蛋白分子量多在41～49 kDa之間[18]。已報道L.acidophilusNCFM和L.acidophilusM92表層蛋白的分子量分別約為46 kDa[26]和45.0 kDa[27],而L.acidophilusATCC 4356 的兩種表層蛋白相對分子質(zhì)量分別為43.6和44.9 kDa[28]。本試驗通過考馬斯亮藍G250測定了粗品蛋白中表層蛋白的含量大概在15.6%左右。SDS-PAGE分析表層蛋白粗品,可以看到一條較寬且明顯的蛋白條帶,分子量大約為43 kDa。所以,可以確定KLDS1.0901含有大量表層蛋白,且分子量約為43 kDa,并且表層蛋白在KLDS1.0901黏附Caco-2細胞和小鼠腸道中發(fā)揮重要作用。